RP-HPLC和紫外分光光度法测定薇菜黄酮含量的参数优化

李凤霞,陈珠钰,孙文笑

(安徽科技学院食品药品学院,安徽凤阳233100)

RP-HPLC和紫外分光光度法测定薇菜黄酮含量的参数优化

李凤霞,陈珠钰,孙文笑

(安徽科技学院食品药品学院,安徽凤阳233100)

本文选取AlCl3分光光度法和反相高效液相色谱法测定薇菜黄酮的含量,旨在确定两种方法的最佳检测条件参数。通过对两种方法涉及的关键参数优化,确定AlCl3分光光度法的最佳条件:以芦丁为标准品,在357 nm下测定,测得薇菜中黄酮的含量为0.746 mg·g-1;反相高效液相色谱法最佳条件:以甲醇-0.04%磷酸(40∶60/v∶v)为流动相,等度洗脱,360 nm下测定,测得薇菜中黄酮的含量为0.798 mg·g-1。反相高效液相色谱法测定精度高,重现性好,但仪器和试剂价格昂贵;AlCl3分光光度法虽然专一性稍差,但它不需要价格昂贵的仪器和试剂,一般实验室均可完成。

薇菜;黄酮;分光光度法;反相高效液相色谱法

薇菜是紫萁科紫萁属多年生草本蕨类植物,资源非常丰富,主要产于皖南山区和大别山区。据文献报道[1],黄酮类化合物是一类低分子量的、广泛分布于植物界的天然植物成分,主要成分是芦丁。大量研究证明[2],黄酮类化合物具有抗癌、抗病毒、抗菌、抗炎、抗过敏、抗血管脆性和血小板聚集及抗糖尿病并发症等多种生理活性与药理作用。黄酮类化合物在人体内不能直接合成,只能从食品中获得,因此近十多年来各国科学家积极研究如何从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分,并进一步加工成具特异功能的保健食品和药品等。因此,能够准确测定薇菜中黄酮的含量是对薇菜黄酮深入研究的必要条件之一。

目前,测定黄酮总含量的方法主要有分光光度法[3-6]、高效液相色谱法[7-10]、毛细管电泳法、薄层色谱法。本研究拟采用AlCl3分光光度法和反相高效液相色谱法来测定薇菜中总黄酮的含量,为薇菜黄酮总含量的测定提供技术参数。

1 材料与方法

用最小二乘法计算回归方程:Y=11.0285X+ 0.0111(Y代表吸光度,X代表浓度)。

1.5.2 反相高效液相色谱法

1.5.2.1 色谱条件

色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6×250mm 5μm);流动相:甲醇-0.04%磷酸(40∶60/v∶v),等度洗脱,水为超纯水,波长360nm,流速1mL· m in-1,柱温35℃,进样量20μL,手推进样,Waters 2487紫外检测器。

1.5.2.2 标准溶液的制备

准确称取芦丁标准品0.0023g,放入25mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,经0.45微孔滤膜过滤后进样,待色谱分析,色谱图见图1。

1.1 原料

将采摘后的新鲜薇菜切段,晒干。将晒干后成段的薇菜经数显鼓风干燥箱烘干直至恒重,经过粉碎机粉碎,过30目筛成薇菜粉末,备用。

1.2 试剂

三氯化铝(AR);无水乙醇(AR);磷酸(AR);芦丁:中国药品生物制品检定所(纯度≥95%);甲醇(色谱纯,美国TED IA)。

1.3 仪器

UV-250岛津紫外分光光度计;高效液相色谱仪:Waters 1525 BinaryhPLC Pump。

1.4 薇菜黄酮的提取

薇菜中黄酮的提取参考文献[11]。

1.5 测定方法

1.5.1 AlCl3分光光度法

1.5.1.1 标准溶液的制备

准确称取芦丁标准品0.0079g,放入25mL容量瓶中,用70%的乙醇定容至刻度,吸取母液5mL,放入25mL容量瓶中,再用70%乙醇定容至刻度,得0.0632mg/mL芦丁标准溶液。

1.5.1.2 最大波长的确定

将芦丁标准溶液放入1cm石英比色皿中,在UV-250岛津紫外分光光度计从200nm扫描到700nm,扫描出最大波长为357nm。

1.5.1.3 标准曲线的绘制

吸取芦丁标准溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00和5.00 mL放入10 mL容量瓶中,分别加入70%乙醇至5mL,再用1%AlCl3定容至刻度,分别放入1cm石英比色皿中在UV-754分光光度计上,波长为357nm处测定吸光度值。

图1 芦丁标准品色谱图

由图1可以看出,色谱图上有一个很明显的峰,但考虑到标准品的纯度问题,把出峰时间延长至20m in。从图上看来,效果较好。但这个色谱峰是由两个峰组成的,表明标准品有两个组分组成,另一个组分为芦丁的异构体,由于要测定的是总黄酮的含量,因此,这对测定结果无影响,可以用这个峰表示芦丁标准品的色谱峰进行定性定量分析。

2 结果与分析

2.1 AlCl3分光光度法测定薇菜中黄酮

精密吸取提取后的薇菜溶液0.5mL放入50mL容量瓶中,用70%乙醇定容至刻度,得样品标准溶液,吸取样品标准溶液5份,每份1mL,按标准曲线的制备操作,空白溶液为参比,测定吸光度值,并代入回归方程,计算出黄酮含量表1。

表1 分光光度法的测定结果

由结果可以看出,加入1%AlCl3减少花色素等酚类物质的干扰,从而可以提高测定结果的准确性。由于提取后的薇菜溶液中黄酮含量太大,可能导致分光光度法测定时结果不精确,因此,将薇菜溶液稀释了100倍,这样在计算薇菜溶液中黄酮含量时,应该乘以这个稀释的倍数,最后计算出薇菜溶液中黄酮含量的平均值为0.746 mg·g-1。

2.1.1 精密度试验

2.1.1.1 标准溶液精密度

精密吸取标准溶液0mL(空白溶液)和1.00mL 4份,以下操作同标准曲线的制备,结果见表2。

2.1.1.2 样品溶液精密度

精密吸取样品溶液1.00mL 5份,以下操作同标准曲线的制备,其中1份不加AlCl3试液作空白,结果见表2。

表2显示了芦丁标准溶液的精密度和样品溶液的精密度,从这个表可以看出,标准品的精密度的RSD=2.6(n=4),样品溶液的精密度RSD= 3.1(n=4),这两组数据可以表明AlCl3分光光度法的精密度很高,专属性很强,适合总黄酮含量的测定。

2.1.2 稳定性试验

为了确定AlCl3分光光度法对测定结果的稳定性,进行了一次稳定性试验,精密吸取样品溶液1mL 2份,其中一份不加AlCl3试液作空白,以下操作同标准曲线的制备,间隔一定时间测定吸光度值,结果见表3。

从表3可以看出,样品溶液在20m in内的RSD=1.5(n=5),说明这种方法的稳定性很好,只要在20m in内测定结果都比较稳定。

2.1.3 加样回收试验

为了证明紫外分光光度法测定薇菜中黄酮含量的准确性,做了加样回收试验。精密吸取样品标准溶液1mL 3份,分别加入1mL的芦丁标准溶液,以下操作同标准曲线的制备,以空白溶液作参比。

表2 精密度试验结果

表3 样品溶液的稳定性实验结果

表4 样品加样回收试验结果

通过以上加样回收试验,测得平均回收率为96.67%,RSD=1.6(n=3),从结果可以看出,回收效果很好,适用于总黄酮的测定。

2.2 反相高效液相色谱法测定薇菜黄酮

将同期样品经0.45μm微孔滤膜过滤后进样,经色谱分析后,结果见表5。

表5 RP-HPLC测定结果

从样品的色谱图来看,样品中含有多个组分,因此,用分光光度法测定时,这些组分对测定的干扰很大。为保证测定的准确性,把出峰时间延长到20m in。从6m in到12m in开始积分,算出峰面积,一共出现了五个峰,只有峰4和标准品的出峰时间接近,因此可判断峰4即可代表样品中黄酮的总组分,可以用于定性定量的分析。

表6 标准溶液精密度试验结果

图2 样品色谱图

表7 样品溶液精密度试验结果

由表5看出,芦丁标准品和样品的出峰时间很接近,根据峰面积的比值可以计算出样品溶液中黄酮的含量,由于提取后的薇菜溶液中黄酮含量太大,将薇菜溶液稀释100倍后测定。通过计算得出薇菜溶液中黄酮含量为0.798 mg·g-1。

2.2.1 精密度试验

2.2.1.1 标准溶液精密度

吸取芦丁标准品溶液,重复进样5次,按上述色谱条件分析,测其峰面积,结果见表6。标准溶液的RSD(%)=1.22(n=5),表明反相高效液相色谱法的精密度很好,受杂质干扰小,准确性好,仪器灵敏度高。

2.2.1.2 样品溶液精密度

吸取稀释后的样品溶液,连续进样5次,按上述色谱条件分析,测其峰面积,结果见表7。

表8 加样回收试验结果

从表7可知,RSD(%)=2.40(n=5),说明这种方法精确度高,适合薇菜中黄酮含量的测定。

2.2.2 稳定性试验

吸取稀释后的样品溶液,每间隔2h进样一次,连续进样3次,按上述色谱条件进样分析,结果表明,薇菜中总黄酮峰面积的积分值的相对标准偏差RSD(%)=1.2(n=3),证明反相高效液相色谱法对测定薇菜样品溶液中的总黄酮含量的稳定性好,受其他物质干扰少,不用重复试验,因此,可以大大节省处理时间,测定精确度高,适合薇菜中总黄酮含量的测定。

2.2.3 加样回收试验

吸取稀释后的样品溶液,加入定量标准品溶液,按上述色谱条件进样,结果见表8。

由表8可知,加样回收试验的平均回收率为99.4%,RSD=1.3(n=3),可见回收效果很好,该方法适合薇菜中总黄酮的测定。

3 讨论

3.1 检测器与流动相的选择

示差折光检测器对流动相的流速、组成、柱温等的稳定性要求较高,仪器本身和外界环境的变化对分析结果的准确性,重现性影响较大,因此,本研究选用紫外检测器检测,效果较好。以甲醇-0.04%磷酸(40∶60/v∶v)组成的流动相[12],流动阻力小,柱平衡时间短,分离效果好,保留时间适中,磷酸的加入也可以抑制黄酮类化合物的酚羟基的电离。从色谱效果图看,非常理想。

3.2 最佳波长选择

在波谱扫描中样品在316nm处有一强吸收峰,通过多次预备性试验,从图2可以看出色谱图效果良好,因此,反相高效液相色谱分析时选择最佳的测定波长为360nm。

3.3 两种方法的可行性

AlCl3分光光度法与反相高效液相色谱法相比稳定性稍差[13],且受花青素等一些多酚物质的干扰,所以测定的总含量相对反相高效液相色谱法偏低。但是两者相比,反相高效液相色谱法对样品的处理比较简单,省却了显色反应的操作步骤,从而也减少了显色剂和显色体系的干扰,测定结果相比之下,更为准确。反相高效液相色谱法相对AlCl3分光光度法而言,测定精度高,重现性好[14],且用反相高效液相色谱法测定样品时,不需要柱前的预处理,大大节省了时间,但仪器和试剂价格昂贵,而且要有合适的标准品,AlCl3分光光度法虽然专一性稍差,但它适合测定样品中总黄酮的含量,且不需要价格昂贵的仪器和试剂,一般实验室均可完成。

4 结论

(1)AlCl3分光光度法的最佳测定条件是以芦丁为标准品357nm下测定,薇菜中黄酮的含量为0.746 mg·g-1。

(2)反相高效液相色谱法的最佳测定条件是以甲醇-0.04%磷酸(40∶60/v∶v)为流动相,等度洗脱,360nm下测定薇菜中黄酮的含量为0.798 mg·g-1。

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新型“TwisterBand TB30”拖链系统

现今,易格斯公司开发出了一款创新的紧凑型拖链系统,可实现3000度旋转运行,且只需极小的安装空间。这款新型“TwisterBand TB30”拖链首次在2010年北京机床展上亮相,便吸引了众多关注。据生产商介绍,它可以很好地为能量、数据和介质提供导向和保护,仅有很小的磨损,具有极高的性价比。在高速旋转时,各种管线紧紧靠在轴上。

通常在高负载旋转运动的时候,易格斯双弯曲半径(RBR)拖链系统是一种很好的选择。基于此系统,最高可实现540度旋转运动。然而,其所需安装空间通常很大。作为易格斯公司旋转拖链系列中的中型尺寸解决方案,另一种选择是“TwisterChain”拖链系统。这种坚固、运行顺畅的拖链同样也是为高动态一圈半旋转运动设计的。

对于那些对安装空间有着极高限制的情况,我们就需要另外一种全新、紧凑、方便填充的微型解决方案。经过长期的开发,易格斯设计师展示了其最新解决方案。这种新型“TwisterBand TB30”系统可实现快速旋转运动,最大可实现3000度或更大角度的旋转,这主要取决于拖链长度或旋转轴的设计高度。由于周长更小,所以离心力也更小,从而可实现更高的旋转速度,最高可达720度/秒。由于其很小的安装尺寸和紧凑的设计,此拖链系统可安全地用于各种安装位置(垂直,水平和高空)。

此款塑料拖链非常轻,且方便使用。其单组件注塑带拥有多个内腔,同易格斯公司的专有“方便型”拖链设计概念相似。无需打开和关闭链接,用户可方便地把各种线缆放入内腔。设计师拥有多达950种“Chainflex”高柔性电缆可供选择,适用于各种应用,同时可选择单个采购,或以预装配接头形式进行采购。

这个新系统的管线是连续不断的,可以是电、气和介质管。系统拥有不同的空间分别适合于不同的管线,例如:伺服/动力电缆,控制、总线或FOC电缆,以及气管和油管。据易格斯公司介绍,一种型号已经可以供货,更多尺寸和型号也在计划中。

这种小巧设计的旋转拖链系统主要用于机器人领域(供应一轴和六轴),以及特殊机器生产,例如:雷达和望远镜等。狭窄空间的旋转运动也常发生在各种物流,提升和装配,以及测试和检测中。另一个应用领域则是风能系统中。

(吴伟)

The Optim um Cond ition to Determ ine The Flavones Con ten t of The Osmund Through RP-HPLC and The Ultrav iolet Spectrophotom etr ic Method

L IFeng-xia,CHEN Zhu-yu,SUN Wen-xiao
(Anhui Science and Technology University,Fengyang 233100,China)

To selectthe op timum detection condition,thispaperchose AlCl3spectrophotometric and RPHPLC methods to detect the contentof the osmund flavones.The results showed that the op timal conditions of the AlCl3spectrophotometric method are based on rutin as standard,and detection wavelength is 357nm.Under these conditions,the flavanone contentof the osmund is 0.746 mg·g-1;the op timal conditions of REHPLC are the methylalcohol-0.04%phosphoric acid(40∶60/v∶v)for flows,and same density eluted under360nm.Under these conditions,the flavones contentof the osmund is 0.798 mg·g-1.The accurary is very high by RP-HPLC method,and thismeans has better rep roducibility,butRP-HPLC method needs expensive apparatus or regents;The AlCl3spectrop hotometric method haspoor specificity,but itdoes not require expensive equipmentand regents,so many laboratories can p rovide the requirmentfor the method.

osmund;flavonoids;spectrophotometric;RP-HPLC

book=11,ebook=63

TS255

A

1005-1295(2010)04-0011-05

10.3969/j.issn.1005-1295.2010.04.003

2010-03-17;

2010-04-26

安徽省高等学校优秀青年人才基金(2009SQRZ108);安徽科技学院引进人才项目(ZRC2007145)。

李凤霞(1978-),女,硕士,讲师,从事农产品贮藏与加工方面的研究。