鱼腥草中槲皮素提取方法的研究

吴景林

(四川利丰化工有限责任公司,成都,610041)

鱼腥草中槲皮素提取方法的研究

吴景林

(四川利丰化工有限责任公司,成都,610041)

本试验通过不同提取试剂和提取方式,以槲皮素含量作为指标,对鱼腥草中槲皮素提取率的影响进行了研究。结果表明,最佳提取条件参数为:提取试剂(乙醇:25%盐酸=4:1),超声波提取50min。该方法操作简捷、迅速、准确、提取率高,为鱼腥草的槲皮素提取提供了一种有效的方法。

鱼腥草 槲皮素 提取方法 高效液相色谱 含量测定

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜(Houttuynia Co rdata Thunb.)的带根全草,主要分布于我国中部、东南及西南部各省区,东起台湾,西南至云南、西藏,北达陕西、甘肃,尤以四川、湖北、湖南、江苏等省居多。常生于海拔300-2600米的山坡潮湿林下、路旁、田埂及沟边。

槲皮素是鱼腥草中一种重要的黄酮类化合物,具有很高药用价值。据文献报道,槲皮素对缺血再灌性心律失常有保护作用;能降低血压,增强毛细血管抵抗力,减少毛细血管脂性,降血脂,扩张冠状动脉,增加冠脉血流量;增强心肌收缩力;舒张肠平滑肌,降低血压,降低胆固醇,降低血小板膜脂质流动性;具有免疫抑制和抗过敏作用,抗癌防癌作用;祛痰、止咳、平喘作用[1-5]。

槲皮素的研究越来越受到人们的重视,对于鱼腥草中槲皮素高效液相色谱测定方法不多,刘文饶等人采用5%硫酸乙醇加热回流提取,测定了不同产地鱼腥草中槲皮素的含量[6]。但是回流提取方法繁琐,操作复杂,且需要4个小时。因此,本试验考察了不同溶剂不同提取方式对槲皮素提取率的影响,力图寻找一种适合鱼腥草中槲皮素提取的快速、简捷、准确的最佳方案,为鱼腥草的化学成分提取工艺提供一种新的思路。

1 仪器与材料

1.1 材料、仪器与试药

试验材料经四川农业大学农学院吴卫博士鉴定为 Houttuynia Co rdata Thunb.。

仪器为Agilent公司1100型高效液相色谱仪(含脱气机、四元梯度泵、自动进样器进样、柱温箱、DAD检测器),Sartorius公司BP211D型电子天平, ICE公司 M icromax型离心机,M illipope公司M illiQ型纯水仪,Autoscience公司溶剂过滤器,Labarey公司微量移液器,超声波清洗机,摇摆式中药粉粹机。

试药乙腈为色谱纯,由 TED IA公司提供,槲皮素对照品(纯度>98%)由Sigma公司提供,其余试剂为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 预处理

将鱼腥草干草在60℃烘箱干燥2小时左右,粉碎过筛(40目),收集细粉备用。

1.2.2 测定条件

色谱柱:Hypersil ODS C18 5μm 4.0mm× 250mm;流动相:乙腈:0.4%磷酸=45:55,调p H值=3;流速:1.0m l/m in;柱温:30℃;紫外检测波长: 370nm。

1.2.3 标准溶液配制和标准曲线制作

精密称取槲皮素标准品0.0224g,用分析纯无水乙醇定溶于 50m l的容量瓶中溶解,制成224.3μg/m l的标准溶液,再将其稀释成22.43μg/ m l的标准溶液。1.2.4 槲皮素含量测定

精密称取过目后的细粉1.00g,倒入50m l的三角瓶中,加入不同溶剂配比的提取液约40m l,然后用不同提取方法提取。取出后趁热过滤,滤干后用提取液洗涤残渣数次,直到把滤纸洗白为止,然后定容至 50m l。取 1.0m l至 1.5m l于离心管中,在10000转/min条件下离心10min,移取上清液作为供试品溶液。准确吸取供试品溶液5μl,注入高效液相色谱仪,按上述色谱进行测定。

槲皮素的含量(mg/g)=(单位峰面积槲皮素含量(mg)×峰面积积分值×50m l)/(5μl×鱼腥草细粉重(g)×1000×1000)

1.2.5 提取方法

本实验采用回流提取与超声提取方式,分别加入不同配比的溶剂进行提取,共10个处理,不同提取方式和试剂配比见表1。

2 结果与分析

2.1 含量测定的方法学考察

槲皮素对照及供试样品分离色谱图见图1。

2.2 线性范围

取浓度为22.43μg/m l和224.3μg/m l的槲皮素对照品溶液,分别进样1、2、5、10μl,按上述色谱条件测定,以峰面积为纵坐标,槲皮素浓度(μg/m l)为横坐标,绘制标准曲线,计算得回归方程为:y= 1.2615x-16.1218(r=0.9997)。表明槲皮素含量在22.43ng～2243ng 范围内具有良好的线性关系。

2.1.2 精密度试验

精密吸取22.43μg/m l对照品溶液5μl,重复进样5次,槲皮素峰面积积分值的相对标准偏差RSD =0.30%。

表2 精密度试验结果

2.1.3 稳定性试验

精密吸取22.43μg/m l对照品及供试样品溶液5μl,分别在0、3、6、9h进样测定,对照品和供试样品的槲皮素峰面积相对标准偏差RSD分别为0.96%和0.99%。结果表明,对照品及供试样品在9h内有良好的稳定性。

表3 稳定性试验结果

2.1.4 重复性试验

精密称取鱼腥草粉末1.00g,共6份,采用优选方法(乙醇:25%盐酸=4:1,超声提取)进行提取测定槲皮素含量,槲皮素含量相对标准偏差RSD= 1.61%。

表4 重复性试验

2.1.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的鱼腥草样品1.00g,分别加入槲皮素对照品,回收率结果见表5,从表中可以看出,平均回收率为101.19%,RSD为2.35%(n= 6)。说明此方法回收性良好。

表5 回收率实验

2.2 提取溶剂的确定

本试验以甲醇和乙醇为提取试剂,25%盐酸和5%硫酸为水解试剂,两者按一定比例混合。结果表明,选择甲醇与盐酸混合试剂的槲皮素最高含量为2.8877m g/g,而乙醇与盐酸混合试剂的最高含量为2.7071mg/g,甲醇稍高于乙醇,但两者差异不大。

2.3 提取方法的确定

本试验分别采用回流和超声两种提取方法对提取效率进行了比较。结果表明,回流提取的最高含量为2.8877mg/g,超声提取最高含量为2.7071mg/g,两种提取方式中回流稍高于超声提取。

2.4 最佳提取条件的筛选

不同提取方法提取鱼腥草的槲皮素含量结果(每个处理3次重复)见表6,从表中可以看出,不同提取方法得到的槲皮素含量不尽相同,含量最高的为处理1(甲醇:25%盐酸=4:1回流提取),含量达2.8877mg/g,其次为处理9(乙醇:25%盐酸=4:1超声提取),含量为2.7071mg/g。不同提取方法的方差分析结果见表7。从中可以看出,不同试剂间差异极显著,提取方式间的差异不显著,提取试剂与提取方式之间的互作不显著,说明该试验主要受单因素(提取试剂)影响。

表6 不同提取方法的鱼腥草槲皮素含量

表7 不同提取方法提取鱼腥草槲皮素含量结果的方差分析

为了寻找最佳组合,采用新复极差法(duncan多重比较)进行进一步测验(见表8)。从表中可以看出,处理1的提取率最高,含量达到2.8877mg/g,处理8的提取率最低,含量低至1.2804mg/g,处理1的提取率极显著高于处理8;处理1、2、3之间具有极显著差异,处理8的提取率显著低于其他处理,说明提取率受甲醇浓度的影响较大,甲醇的浓度越大,槲皮素的提取率越高;处理5、10采用的是5%硫酸作为水解试剂,与其他处理组合相比较,差异不显著,说明水解试剂无论是25%的盐酸还是5%硫酸均能将鱼腥草中的槲皮素苷元类黄酮苷水解为苷元,硫酸与盐酸相比较,从安全和经济上考虑,优选盐酸作为水解试剂;处理4、5、9、10采用的是乙醇,其他处理均采用的是甲醇,甲醇乙醇之间差异不显著,说明甲醇乙醇均可以作为槲皮素的提取试剂,均能将槲皮素提取完全,但甲醇有毒,且价格比乙醇更昂贵,从安全和经济上考虑,宜选用乙醇作为提取试剂;从提取方式上考察,回流提取的提取率要稍优于超声提取,但两者差异不显著,超声提取方式更简捷,快速。综合以上因素,我们选择处理9,即采用乙醇:25%盐酸=4:1作为提取试剂,超声提取。

表8 不同提取方法提取鱼腥草槲皮素含量结果的Duncan多重比较

3 讨论与结论

(1)通过本次试验,我们找到了一种鱼腥草中槲皮素提取的适宜方法,即采用乙醇:25%盐酸=4:1作为提取试剂,超声提取,该方法简捷快速准确可靠。同时,通过方法学考察,验证了刘文饶等人[6]采用高效液相色谱法测定鱼腥草中槲皮素含量试验的可靠性。

(2)回流与超声提取均能将鱼腥草中的槲皮素提取完全,回流的提取率稍高于超声提取,本试验所得出的结论与王晖等人在进行透骨草中槲皮素含量测定的实验中[7]的结论基本一致,我们选择超声提取是为了节省时间和工作量,并且超声提取更节省能源,既快捷简便又经济。

(3)周军辉等人在测定不同产地紫菀中槲皮素的含量时采用了超声提取,考察了超声时间对提取的影响,结果显示超声提取50min为佳[8]。本试验同样选择50m in,处理20m in后,为了避免样品过热和保护超声波清洗机,间隔10min后再处理20min。共耗时50m in,处理时间对提取率的具体影响还有待进一步研究。

(4)甲醇与乙醇都能够将鱼腥草中槲皮素提取充分,周军辉等人认为甲醇提取效果更好[8],通过本次试验发现,甲醇乙醇之间的差异不显著,选择二者均可,但从安全和经济角度考虑,选择乙醇更为适宜。

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Abstract:On the index of content of quercetin in Houttuynia co rdata Thunb.,the op tim um extracting reagent and method was investigated in thisexperiment.The result showed that the extracting reagent is CH3CH2OH:25%HCl=4:1,and ultrasonic extracting fo r 50 min w ere op timal parameter.The method w as simp le,quick,accurate and high extracted rate,w hich was an effective method for extracting quercetin in H.co rdata.

Key words:houttuynia cordata thunb.;quercetin;extracting method;HPLC;content determination

Study on Extracting Method of Quercetin in Houttuynia Cordata Thunb.

W u Jing lin
(Sichuan L ifeng Chem ical CO.L TD,chengdu,610041)