分子印迹固相萃取技术在食品有害物质分析中的应用

吕瑞鹤 万郑凯 何 娟

(1.河南工业大学化学化工学院,河南郑州,450001;2.河南农业大学理学院,河南郑州,450001)

分子印迹固相萃取技术在食品有害物质分析中的应用

吕瑞鹤1万郑凯2何 娟1

(1.河南工业大学化学化工学院,河南郑州,450001;2.河南农业大学理学院,河南郑州,450001)

固相萃取是对样品富集、分离的一种有效方法,因而得到广泛应用。分子印迹是近些年发展起来的新技术,由于分子印迹聚合物具有高的选择性,被应用于环境、药物、生物、食品等样品的分析。本文介绍了固相萃取和分子印迹技术的原理以及两者结合用于固相萃取的过程,对近10年来国内外分子印迹固相萃取技术在检测食品中农药和兽药残留方面中的应用、分子印迹固相萃取技术在应用中存在的问题以及将来的发展进行了展望。

分子印迹聚合物 固相萃取 食品安全分析 在线 离线

在分析实际样品过程中,由于样品预处理过程复杂,所耗费的时间较长,因此在整个分析过程中最有可能出现误差和错误。目前,样品预处理过程常用的方法有液-液萃取(Liquid-Liquid Extraction,LL E)和固相萃取(Solid-Phase Extraction,SPE)。SPE是从溶液中萃取和分离分析物的一种技术,是作为补充或取代LL E而发展起来的。与LL E相比,由于其具有操作简单、使用灵活、回收率高、处理的样品体积小、消耗溶剂少、易于自动化等优点,被许多实验室和分析工作者所采用。SPE是一个柱色谱分离过程,其分离机理、吸附剂和溶剂的选择等方面与高效液相色谱(HPLC)有许多相似之处。根据吸附剂性质不同,SPE吸附剂可分为正相吸附剂(硅藻土、硅胶、氧化铝、硅酸镁等),反相吸附剂(C8、C18等)和离子吸附剂。另外还有一些特殊吸附剂如免疫、聚合物吸附剂等。常用的吸附剂由于缺乏选择性,对复杂的环境、生物体系中的样品很难进行分离,而免疫吸附剂虽然选择性好,但由于操作复杂、稳定性差、合成周期长、价格昂贵等缺点,所以它的应用在一定程度上受到限制。随着环境、生物等复杂体系样品的增多,分析工作者急需一种克服上述缺陷的新型吸附剂,而分子印迹聚合物 (Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)恰好可以满足这一需求。

1 分子印迹固相萃取原理

用分子印迹聚合物装填的固相萃取柱叫分子印迹固相萃取柱(MISPE),分子印迹聚合物是一种新兴的分子识别材料,它模拟自然界存在的分子识别作用,如酶与底物、抗体与抗原等特异性识别机制,人工制备的具有对“模板分子(待分离、识别的分子)”选择性结合位点的聚合物,由于它预识别能力较高,稳定性较好,制备方法简单,成本低,潜在的应用前景而受到广泛的关注[1]。在作为SPE吸附剂时,MIPs一般有下面几种合成方法:本体聚合[2]、原位聚合[3]、悬浮聚合[4]、多步溶胀聚合[5]等。其中本体聚合是传统的制备MIPs的方法中最常见和使用最广泛的。即将模板、功能单体、交联剂、引发剂和溶剂加入反应器中,混合溶液中通入氮气除氧,然后密封。聚合以后,合成的块状聚合物需通过研磨、筛分,得到适当的MIPs颗粒。通过溶剂洗脱或在一定条件下水解除去模板分子,聚合物中就留下了空穴,其大小、形状及留下来的结合位点与原来模板分子完全匹配,这样的空穴便可以与混合物中待分离的分析物进行可逆的特异性结合,从而达到分离、纯化、富集的目的[6]。

MIPs作为SPE的吸附剂可以弥补普通吸附剂选择性差的不足,而且要比免疫吸附剂的稳定性好,还可以重复使用多次,因此在复杂环境、生物等体系中少量物质的分离富集以及药物的纯化方面都表现出很好的应用。

MISPE的操作模式分为在线模式(on-line)和离线模式(off-line)。在线模式指的是将MISPE柱与其它仪器相连。目前MISPE采用最多的还是离线模式,这种模式比在线操作简单,可选用的溶剂较多,因此有更高的富集倍数和较好的选择性。离线模式一般分为4个部分:活化(conditioning)、上样(loading)、淋洗(washing)、洗脱(eluting)。

2 MISPE食品安全分析中的应用

近年来,食品安全性问题日益突出。食品中农药、兽药残留严重危害人民的健康,世界各国均在积极制定相关法令政策及研发更为快速、准确、灵敏的检测方法。许多食品样品的基体和组成相当复杂,被分析物处于痕量状态,易受到干扰,样品前处理方法已成为食品安全分析关键步骤。近几年MISPE方法越来越多地应用于食品中化合物的富集、分离,研究对象包括食品中杀虫剂和药物的残留,食品中的风味物质以及添加剂。

2.1 食品中药物残留方面分析

食品中的农药残留含量一般都很低,上机分析前就必须对其进行提取和富集操作,分子印迹固相萃取柱具有特异性和亲和性,可克服样品体系复杂、预处理繁杂等不利因素,提高分析仪器的检测能力。

Chap uis等[7]报道了以特丁津和莠灭净为模板分子,采用低温紫外引发制备印迹聚合物,用该聚合物装填3mL固相萃取柱,能从复杂基质葡萄酒和土壤中选择性萃取加标莠去津及其代谢物,与免疫亲和层析柱(Immunosorbents IS)的分离、净化、富集效果比较,结果表明两者的液相图谱分离效果相当,在10-8级检测中,均能达到基线平稳、定量准确。

Tamayoa等人[8]用分子印迹技术检测蔬菜中残留的苯基脲类除草剂,采用硅胶为牺牲载体的新方法合成分子印迹聚合物,以异丙隆和利谷隆作模板分子,以甲基丙烯酸(MAA)和三氟甲基丙烯酸(TFMAA)作功能单体,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、偶氮二异丁氰(A IBN)和无水甲苯,再加入有孔硅胶,剧烈摇动使聚合物混合物渗透至硅胶孔内,采用热引发制备聚合物,最后用甲醇抽提除去模板分子。用该聚合物装填 HPLC柱可直接检测蔬菜样品中的苯基脲类除草剂,检测限可达0.1μg/g。

2.2 食品中兽药残留方面的分析

兽药残留分析样品中基质复杂、干扰物质多,样品基质和待测组分具有不确定性。待测物的样品前处理和检测是药物残留分析的2个基本主题。现阶段兽药残留的检测工作逐渐简化,而样品前处理越来越成为分析过程中的关键。MISPE使兽药残留分析的前处理迈上一个新台阶。

氯霉素是一种有效的广谱性抗生素,它可当作人体药物和兽药使用,但是不当使用也可能导致使用者中毒。Schirmer等人[9]检测蜂蜜及其他蜂产品中的氯霉素时,用氯霉素为模板分子,MAA为功能单体,用 EDMA作交联剂、AIBN为引发剂和氯仿为溶剂,于60℃热引发24 h制得分子印迹聚合物,用该聚合物装填固相萃取柱对蜂产品中氯霉素进行富集,用RP-HPLC定量检测,该方法对氯霉素的检测限能达0.1μg/mL。

Baggiani等[10]研究了用MIPs用作固相萃取柱中的吸附材料来分离纯化葡萄酒中的嘧啶胺类杀菌剂。分子印迹聚合物用有孔氯珠为基质,用MAA为功能单体,以EGDMA为交联剂制备印迹聚合物并作为固相萃取柱的填料,分离富集红酒中的杀菌剂嘧霉胺,分离纯化后用 HPLC检测,该方法能选择性地检测出嘧霉胺,而非嘧啶胺类如苯霜灵,克氯得及其他结构类似物均未检出,检测限能达0.1μg/mL。

De Prada等[11]研究了一种在线MISPE过程用来选择性富集和伏安法测定牛奶中衡量的磺胺甲基嘧啶,通过实验得到的浓缩因子为45。这种方法的检测限低于国际食品法典委员会标准规定(牛奶中磺胺甲基嘧啶的最大残留量25 mg/L),因此可以定量的检测牛奶中的磺胺甲基嘧啶残留。

2.3 食品中有害添加物质物质及生物毒素的分析

食品中的有害物质除了农药和兽药残留,还有食品添加剂和禁用物质的违规添加。苏丹红Ⅰ属于偶氮类化工染色剂,其化学衍生物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均具有致癌性,因此在食品中禁止使用。2004年,欧盟开始要求禁止进口掺有苏丹红的辣椒产品。Puoci等[12]建立一个简单的MISPE方法从食品中预富集痕量的苏丹红Ⅰ,结果表明当使用 HPLC不能检测到苏丹红Ⅰ时,MISPE是一个有效地检测痕量苏丹红的方法。

周文辉等[13]采用以三聚氰胺为模板分子合成了对三聚氰胺具有较好选择性的分子印迹聚合物。以该分子印迹聚合物为固相萃取材料填充固相萃取小柱,可以从奶粉、纯牛奶等奶制品中选择性地分离、富集三聚氰胺,并有效地去除奶制品中的复杂基质,取得了良好的效果。对奶粉和液态奶提取液的加标回收率分别为91%～103%、93%～98%,相对标准偏差(n=3)分别为719%和 111%。该分子印迹聚合物还有望用于其它奶制品的分析。

Maier等[14]用MISPE方法来检测红酒中的致癌物质毒汁菌素赭曲霉素,他们发现非印迹聚合物与MIPs对模板分子具有相类似的选择性,并且将NIPs代替MIPs作为SPE的吸附剂来避免模板分子的流出。

Zhou等[15]发明了一种在线MISPE-PE方法,使用荧光检测器来快速检测小麦中的赭曲霉素A,每一个分析过程低于5分钟。而且,MISPE-PE与LC/MS联用可以对赭曲霉素A进行快速的定性和定量分析。

3 MISPE的存在问题及展望

虽然MISPE在复杂环境体系的分析中显示了其优越性并取得了很大进展,但是仍然存在一些问题有待解决。具体表现为以下几方面:(1)结合位点的作用机理、传质机理仍不清楚,从分子水平上更好地理解分子识别过程仍需开展大量工作;(2)目前MIP在合成后模板分子渗漏现象难以得到根本解决,限制了MIT在痕量分析中的实际应用。解决此问题的有效方法是采用替代模板聚合法。以后在MIP制备方法上需进行更多探索性工作;(3)印迹聚合的过程和MIPs的应用一般在有机溶剂中进行,这与天然的分子识别过程大多发生在水溶液中相矛盾,因此将印迹过程和识别过程从有机相向水相的转化仍是个难题。

MISPE极大提高了固相萃取的选择性,简化了样品前处理,但该技术仍不很完善。如其容量不够大,富集倍数不够高;识别能力受上样溶剂影响较大,在水溶液中选择性较差;结合位点的非均一性和低传质效率阻碍萃取效率和选择性的提高;分子印迹萃取剂的种类有限等。MISPE应在以下几方面完善发展:(1)新型分子印迹固相萃取剂的研究;(2)加强与其他样品前处理技术的融合渗透;(3)将MISPE与其他分离检测方法如毛细管电泳、免疫分析、生物传感器等结合是未来MIT在兽药残留分析中应用研究的热点;(4)食品的安全问题还包括包装材料的有害物质迁移到食品中。包装材料的有害物质向食品迁移极大地危害了人民的健康,因此有害物质的迁移越来越受到关注[16],对迁移到食品中的有害物质的分析将成为一个热点。

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Application of Molecular Imprinting Solid Phase Extraction Technique in Food Safety Detection

LvRuihe1,WanZhengkai2,HeJuan1
(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversityofTechnology,HenanZhengzhou450001,China;2.CollegeofScience,HenanAgriculturalUniversity,HenanZhengzhou450001,China)

Solid phase extraction is an effective method to enrich and separate samples.Molecularly imprinted Polymers with high selectivity are applied in the areas of environment,drugs,organisms,food,etc.The principles of solid phase extraction and molecularly imprinted polymers and the operation procedure of solid phase extraction using molecularly imprinted polymers as the sorbents are introduced.The correlative papers published about applications of molecularly imprinted solid phase extraction in determination herbicide and兽药 residue are discussed,including recent advances and the problems.

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