菌糠酶提取与制备方法研究

刘莹莹，张 坚，王红兵，肖兵南

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131；2.湖南光大牧业科技有限公司，湖南长沙410131）

要从菌糠中获得干酶制剂，必须经过提取、浓缩、干燥等过程。笔者从4种不同的提取方法中选择酶提取率最高的方法，然后比较3种不同的浓缩方法，拟从中选择较优的一种，最后采用真空干燥的方法来获得干酶制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

实验试材为香菇菌糠，从湖南省春华食用菌有限公司获得。透析袋的截留分子量为12 000，产自联合碳化物公司。

试剂：硫酸铵，无水乙醇，2%碳酸氢钠，1 mmol/L EDTA，氢氧化钠，pH 4.8、0.05 mol/L柠檬酸缓冲液。

主要仪器：真空干燥箱，紫外可见分光光度计，电热鼓风箱，自动纯水蒸馏器，电子分析天平，电热恒温水浴锅，匀浆机，台式冷冻离心机，酸度计，移液枪，离心管。

1.2 方法

1.2.1 粗酶提取方法的筛选[1]取自然干燥的菌糠加10倍蒸馏水，置于匀浆机中充分打碎，然后采取4种不同的处理：（1）在40℃恒温水浴中浸提45 min；（2）在 40℃恒温水浴中浸提 90 min；（3）在室温（10℃）下浸提 90 min；（4）在室温（10℃）下浸提12 h。各浸提液经多层纱布过滤，滤液以3 000 r/min离心5 min，得上层清液即为粗酶液。各粗酶液用缓冲液稀释适当的倍数，测定纤维素酶活（CMC酶活）。

1.2.2 3种方法浓缩粗酶液的比较 （1）乙醇沉淀法：取粗酶液50 mL，缓慢加入无水乙醇并不停地搅拌，直至产生混浊，4℃静置过夜，4 000 r/min离心15 min，收集上清液和沉淀，并用1 mL蒸馏水溶解沉淀，分别测定上清液和沉淀物中的CMC酶活；（2）硫酸铵沉淀法：取粗酶液50 mL，加固体硫酸铵至30%饱和度，4℃静置过夜，4 000 r/min离心15 min，收集上清液和沉淀，并用1 mL蒸馏水溶解沉淀，分别测定上清液和沉淀物中的CMC酶活；（3）中空纤维膜过滤法：取粗酶液5 000 mL，选用中空纤维超滤小型试验装置，在0.1 MPa下，首先经截留分子量分别为100k的膜过滤，收集流出液，再经过截留分子量分别为3k的膜过滤浓缩至100 mL，取样测定CMC酶活和木聚糖酶酶活。

1.2.3 对沉淀物的透析 透析袋的准备[2]：将透析袋剪成合适长度，约15 cm。在250 mL烧杯中加入大量的2%碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA。将透析袋放入其中，煮沸10 min。用蒸馏水彻底洗涤，然后在蒸馏水中煮10 min。冷却后4℃存放，在贮存过程中透析管应完全浸于水中。使用前用蒸馏水清洗透析管内外，操作时用镊子或戴手套。

使用时，一端用细绳扎紧，由另一端灌水，用手指稍加压，检查不漏方可装入待透析液，通常要留1/3至1/2的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。

1.2.4 酶液的透析 向1 L粗酶液中加入固体硫酸铵至80%饱和度，4℃放置过夜，4 000 r/min离心20 min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解，装入透析袋中，置于4℃冰箱中，用pH4.8、0.05 mol/L柠檬酸缓冲液充分透析，每隔3 h更换一次透析液，透析12 h，得到除盐的酶液，分别测定酶液中的CMC酶活和木聚糖酶酶活。

1.2.5 酶液的干燥 将透析后的酶液放入真空干燥箱中，40℃恒温干燥，干燥物磨粉后即得到干酶制剂，分别测定其中的CMC酶活和木聚糖酶酶活。

2 结果与分析

2.1 粗酶提取方法的筛选结果

酶是生物活性物质，其提取过程受多种因素如温度、时间、溶剂种类等的影响。为了最大限度的提取酶活，尽可能减少各种因素引起的酶活损失，故应选择最合适的条件。把最高酶活定为100%，测定结果见表1。结果表明，在室温（10℃）下用蒸馏水浸提12 h，所得的粗酶液的相对酶活最高，也就是说酶的提取率最高，因此该提取方法最佳。

表1 提取方法对纤维素酶提取率的影响

2.2 3种方法浓缩粗酶液的比较

3 种浓缩方法浓缩粗酶液的结果见表2，从表2可以看出，粗酶液经硫酸铵沉淀后，上清液和沉淀物的CMC酶活均明显高于乙醇沉淀法对应的酶活，说明硫酸铵沉淀法优于乙醇沉淀法。中空纤维膜超滤法所得清澈弃去液的酶活最低，而沉淀物的酶活最高，表明此法最优。可能由于乙醇对酶的活性有影响而影响酶活力大小，硫酸铵沉淀后必须将沉淀透析去盐，工艺复杂。膜过滤法方法简单、效果好、一步到位。

表2 浓缩方法对纤维素酶酶活的影响(IU/g)

2.3 对沉淀物透析的结果

粗酶液经硫酸铵沉淀，离心，收集的沉淀物中含有大量的硫酸铵，因此必须将硫酸铵除去。按照1.2.3的方法，得到除盐的酶液，其CMC酶活和木聚糖酶酶活见表3。

表3 透析后酶液中酶活的测定结果 （IU/g）

2.4 酶液的干燥

按照1.2.5的方法，制得干酶制剂，其CMC酶活和木聚糖酶酶活见表4。结果表明，50 g干酶制剂中纤维素酶总酶活达8 021 IU，木聚糖酶总酶活达14 483 IU。

表4 干酶制剂中酶活的测定结果 （IU）

3 讨论

3.1 酶的提取方法对酶提取率的影响

许尧兴[3]报道，酶粉用蒸馏水浸提，40℃水浴浸泡30 min，酶粉中酸性蛋白酶提取最完全。也有资料报道，酶粉采用与测定底物相同pH的缓冲液浸提，酶提取最完全。由于本试验是从菌糠中提取酶，情况有所不同，在室温（10℃）下用蒸馏水浸提12 h，酶提取最完全。

3.2 关于酶的浓缩、干燥

从香菇菌糠中提取的酶液，经膜过滤法浓缩，沉淀物中纤维素酶酶活最高，达187.8 IU/g，膜过滤法方法简单、效果好、一步到位。粗酶液经硫酸铵沉淀，然后透析除盐，再经真空干燥，制得干酶制剂，其中纤维素酶总酶活达8 021 IU，木聚糖酶总酶活达14 483 IU，可见其酶活非常高。同时还可以完善生产工艺，如采用冷冻干燥，可进一步提高酶活。由此来看，香菇菌糠具有开发饲用酶制剂的潜在价值。

目前，我国还有大量菌糠没有被合理利用而浪费，本研究以菌糠为原料来开发饲用酶，变废为宝，无疑可以降低生产饲用酶的成本，提高经济效益，但生产工艺需进一步完善。

[1]陆文涛.固态发酵饲料用纤维素酶活力的测定分析[J].饲料研究，2001，（12）：3-5.

[2]诸葛健，王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京：中国轻工业出版社，1994.155-279.

[3]许尧兴，许少春，姚晓红.不同测定程序对饲用酸性蛋白酶检测的影响[J].中国饲料，2001（14）：26-28.