电子顺磁共振测量蛋白质分子内选定位点之间距离的方法及应用

吴 可

军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850

电子顺磁共振测量蛋白质分子内选定位点之间距离的方法及应用

吴 可

军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850

蛋白质分子的结构决定了其特性和功能，准确测量蛋白质分子中特殊位点之间的距离对其结构解析至关重要。该文在简要介绍电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）方法测量蛋白质分子内未偶自旋之间距离基本原理的基础上，重点综述了近年来EPR结合定点自旋标记（site-directed spin label，SDSL）技术在研究蛋白质结构与功能方面的应用情况，归纳了EPR-SDSL方法测量距离的特点和存在问题，并提出了改进用连续波EPR技术测量距离的准确度的思路和实现方法。

电子顺磁共振；定点自旋标记；距离测量；蛋白质结构

0 引 言

蛋白质分子中功能集团的位置、取向、运动及其变化在其发挥生物功能的活动中起着关键作用。近年来，结构蛋白质组学研究的迅速进展，促成了蛋白质数据库新蛋白数量大量增加，其中包括大量膜蛋白，而相应的膜蛋白结构的分析研究却相对进展缓慢。由于蛋白构象变化是膜蛋白执行特定功能的基本要素，所以仅从静态结构分析往往难以完全解释许多功能性蛋白质的作用机制。膜蛋白的运动常用一些假设的运动形式来描述，如：膜受体、离子泵、离子通道等蛋白质的复杂的功能性运动可以形象地描述为一些蛋白质子结构的机械运动过程，然而在溶液环境下，对于膜蛋白发挥生物功能过程中的构象变化目前尚缺乏高分辨的结构分析技术来表征。电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）结合定点自旋标记技术可能成为解决这一重要却相对复杂问题的有效方法。现代分子生物学技术可以有目的地将蛋白质分子中特定位点的氨基酸突变为半胱氨酸，这样就可以在这些位点处标记上可与巯基（-SH）特异结合的顺磁性标记物，这就是定点自旋标记（site-directed spin label，SDSL）技术。如用一对氮氧基分别标记在两个特定位点，两个氮氧基间将产生偶极相互作用，其作用强度与两个氮氧基间距离的立方成反比，则通过分析EPR波谱的偶极增宽效应，可以确定氮氧基之间的距离，这种方法为研究膜蛋白的结构与功能提供了新的分析手段。

目前可以测量蛋白质分子内距离的主要方法有X射线晶体衍射和核磁共振（NMR）技术等。X射线晶体衍射的分辨率较高，可达到0.12 nm，但由于许多具有生物学活性的蛋白系统（如：含有金属离子或与膜结合形成了蛋白复合物）难以获得结晶样品，而且多数蛋白质都是在溶液环境中并不是以结晶状态下发挥生物功能，只能在溶液或冰冻溶液状态下分析，在这些情况下，X射线晶体衍射方法会受到限制，给出的结果不能完全反映蛋白质实际发挥功能时的结构状态。二维NMR技术可以在溶液状态下测量蛋白质的距离，但NMR测距原理将其测量范围限制在0.6 nm内，而且NMR只适用于检测一些小分子蛋白质，对于大量具有生物活性的膜蛋白和大分子蛋白复合体则无能为力，而获得这些蛋白质在发挥生物功能的溶液状态下的结构和运动变化信息却是十分重要的。EPR是通过测量未偶电子的自旋-自旋相互作用强度获得自旋间的距离信息，借助EPR技术可以实现对蛋白质分子上感兴趣位点之间的距离和自旋取向的分析。其主要特点在于：1）EPR只对未偶电子敏感，受其它因素干扰较少；2）检测的温度范围较宽，在生物样品的活性温度范围内都可用EPR检测；3）由于电子磁矩μe比原子核磁矩μp大得多（μe/μp=658），所以利用电子磁矩相互作用效应可测的距离更长。

1 EPR测量距离原理

EPR测量未偶电子之间距离的基本原理[1]是依赖于自旋磁矩之间存在的偶极相互作用，即从一个自旋产生的磁场作用到另一个自旋磁矩的强度，如图1所示。图1中r为两个未偶自旋磁矩μe1和μe2之间的连线。在随机分布情况下，r与外加磁场B0之间会有一定的夹角θ，μe2受到从μe1产生的磁场的作用强度WDD为：

μ0为磁导率，β为波尔磁子，g1、g2分别为两个未偶自旋的g因子。

图1 未偶自旋相互作用及其与距离的关系Fig.1 The interaction of unpaired spins and their distance relationship

目前利用EPR测量距离的方法分为连续波（continuous wave electron paramagnetic resonance，CW-EPR）方法和脉冲电子-电子双共振（electron-electron double resonance/double electron-electron resonance，ELDOR/DEER）方法。

1.1 连续波EPR测量距离方法

两个未偶自旋偶极间的相互作用会使EPR原始谱线产生分裂变形，当此作用强度明显大于单自旋CW-EPR信号的波谱线宽时，可通过分析谱线增宽的变化得到偶极相互作用强度信息。但对于快速转动的自旋对而言，即自旋对的转动速度相对于用频率表示的相互作用强度要快时，相互作用的空间信息被平均，则不易观测到偶极分裂现象，所以实验方法应尽可能灵敏地检测出偶极相互作用强度，并将之与影响波谱变化的其它因素有效地分开，从而从波谱中提取出距离信息。目前，连续波EPR测量距离采用最广泛的是波谱去卷积方法。该方法将两个相互作用的自旋电子对波谱看作由没有相互作用的单自旋粉末谱与一个偶极增宽函数D(r,B)相卷积构成，此增宽函数称为“Pake”函数。可以用单自旋波谱对含有偶极相互作用的双自旋增宽波谱进行傅里叶去卷积计算，来获得代表相互作用强度的增宽函数。此方法须有一前提，就是事先要获得单自旋波谱。我们综合了目前利用该原理的各种实际应用方法，并针对目前这一方法还缺少距离准确度的校正方法等实际问题，将其实现过程和需进一步改进之处（应增加距离校正过程）归纳如图2所示。

图2 连续波EPR测量距离方法框图Fig.2 Process frame of distance measurement by CW-EPR

用连续波EPR技术测量距离，除上述的波谱傅利叶去卷积计算方法外，还有波谱模拟法、半场跃迁（half-field transition）相对强度法、半场峰高比值d/d1方法等。

1.2 脉冲电子-电子双共振(ELDOR/DEER)测量距离方法

用CW-EPR技术测量偶极相互作用依赖于波谱线宽的明显增宽效应。受EPR谱线自身线宽的影响，当自旋之间距离大到一定程度时，其偶极相互作用强度会变得很弱，由此引起的谱线增宽效应会下降，甚至被淹没在各种各向异性波谱增宽效应中，所以长距离测量更多采用脉冲EPR方法。脉冲技术比连续波测量的距离更长，是因为其距离信息由自旋簇的宽度决定，此宽度与回波的相位失相干速率相关，它通常比CW-EPR波谱的非均匀增宽程度小得多。当温度在80 K以下时，氮氧自由基自旋回波的相位失相干时间常数Tm通常在2 μs左右，它相当于线宽为3 μT的自旋簇。所以对CW-EPR线宽而言，相对较小的相互作用强度对脉冲回波自旋簇的线宽影响却很显著，这一特性决定了用脉冲技术测量长距离更有优势。ELDOR/DEER是通过对一个自旋的波谱范围进行扰动的同时观测另一个自旋的时间响应特性。偶极相互作用强度以多重振荡形式调制回波强度，此振荡频率中含有自旋间距离的信息，通常需用一系列脉冲组合来完成这种测量，对特殊的自旋系统还须建立特殊的脉冲组合。如：3-脉冲ELDOR、2+1脉冲ELDOR序列、4-脉冲DEER、双量子相干检测（double quantum coherence，DQC）等。其中的4-脉冲DEER可以避免脉冲响应死期的影响，它与DQC技术可测量的最大长度均可达到8 nm。随着距离的加大，需要样品的浓度更低，以保证分子内不同自旋之间的距离要比不同分子之间的距离小得多，这对脉冲仪器的检测灵敏度提出了更高的要求。某些情况下，还需要同时激励样品中所有的自旋以确定全部偶极增宽函数，但目前技术很难获得可激励全部波谱的脉冲带宽。当波谱被强偶极相互作用显著增宽后，这一问题就更加严重，所以目前脉冲技术最适合的距离测量范围是1.5～8 nm。距离测量精度在低端大约0.3 nm，而在中段约为0.2 nm。此外，高频EPR技术增加了取向选择性的范围，所以目前许多工作已应用Q波段甚至W波段DEER方法。

1.3 距离分布

许多系统中未偶自旋间的距离不是一个固定值而是存在一个分布范围，这一点在数据分析时必须考虑。即使自旋标记物标记在已明确了结构的蛋白质分子中，由于分子的微运动也会使距离产生分布，EPR测量距离主要的不确定性来自于对距离分布情况的处理，关键是要根据相互作用强度对距离的依赖关系和标记物分子或自旋中心的取向因素，得到合理的分布函数，否则会导致测量的准确度比预期低。另外，蛋白分子的未完全标记是EPR测量距离误差的另一主要来源。综合考虑各因素，通常认为EPR测量距离的误差约0.2 nm。

2 距离测量在蛋白质分析中的应用

大量研究表明，EPR-SDSL在解决复杂蛋白质系统的运动、构象变化及与周围环境相互作用等机制方面，可以提供其它方法无法获得的重要信息，它是对X射线晶体衍射和NMR方法很好的补充，解决了许多蛋白质研究中的热点问题，如：难以获得结晶的膜蛋白和大分子蛋白复合体的结构分析、蛋白质的区域折叠状态、溶液状态下蛋白质构象的动态变化、蛋白质与蛋白质之间以及蛋白质与其它生物大分子之间的相互作用等。这一技术近年来得到了很快发展和广泛应用[2～8]。Hubbell等[9,10]开展EPR-SDSL分析蛋白质结构与运动的工作较早。Voss等利用此技术测量了大肠杆菌膜上乳糖通透酶蛋白上的金属离子与自旋标记之间的距离。通过在螺旋体上定点自旋标记，利用未偶自旋磁矩与螺旋体3和4之间的金属离子相耦合作用，确定了突变点103、111、121与金属离子间的距离分别为0.8、1.4、2.3 nm，这一结果与通透酶跨膜域的螺旋体构象相符合[11]。对离子通道MscL在受到刺激信号后的结构重组过程和其开闭控制机制的研究，发现了开启状态的高运动性导致第一个跨膜螺旋体TM1相连形成水填充孔[7]。通过测量距离信息，可以计算出膜蛋白的构象变化，例如在链霉菌钾离子通道 (KcsA)上构建10对半胱氨酸残基，测量各残基对之间距离的变化，在通道闭合时最小距离为0.85 nm，最大大于2.5 nm；开启时最小距离1.1 nm，最大距离2.4 nm，各残基对间最大距离差可达0.94 nm，检测误差约为0.1 nm，从而获得了KcsA的第二个跨膜域 (TM2)在通道开启过程中的构象改变。确定了通道开启过程是通过MT2段以中央螺旋为轴的剪刀型运动完成的，这一方法大大减少了膜蛋白构象变化的分析时间和难度[12]。通过检测对配体依赖型药物传输体MsbA构象的变化，建立了与ATP结合的抗多药物传输体的运动结构基础[13]。X射线衍射法不能检测肌球蛋白因磷酸化作用而引起的结构改变，通过点突变在肌球蛋白的轻链引入半胱氨酸残基，发现肌球蛋白N末端(前24个氨基酸)在磷酸化后运动性发生了显著变化，通过偶极-偶极相互作用测定残基间距离，用于底物跨膜转运、膜通道关闭、基因调控以及信号传导的研究，可为多种类型处于部分折叠状态的蛋白质提供结构信息[8,14]。测量分子间距和分子内距离还可以确定蛋白与蛋白及蛋白与寡核苷酸之间的相互作用[8]；得到人血红蛋白四聚体的构象变化[15]；确定钙离子诱导的人心肌肌钙蛋白C与肌钙蛋白Ⅰ复合体的N末端结构变化[16]；区分蛋白复杂运动的细节及跨膜域的运动特征和包含蛋白体的大脂质群与结合型脂的结构[6]。将自旋标记侧链标在视黄醇结合蛋白质的反平行β折叠结构中，测量分子内距离证明了其运动性与其结构和邻近亚基的相互作用有关[17]。

除引用SDSL外，还可以利用蛋白质分子中自身存在的顺磁性物质或反应中产生的顺磁性中间体，实现蛋白中特殊位点间距离的测量，如：利用水解酶中的[Ni-Fe]中心与周围顺磁性粒子之间的距离测量；Christopher测量人肝再生因子（ALR）在催化巯基氧化过程中产生的黄素自由基间的距离为(2.6±0.8)nm[18]。ALR是一种黄素依赖型巯基氧化酶二聚体，利用分子氧催化巯基氧化生成二硫键，同时产生中性的黄素自由基，这一结果与晶体分析得到的大鼠ALR结构近似，从而确定了可以用大鼠ALR结构作为人ALR的研究模型。Bennati等[19]研究了大肠杆菌核糖核酸还原酶在催化核酸磷酸化变为脱氧核糖双磷酸过程中，功能蛋白质（RNR）分子中两个独立二聚体单元R1亚基的酪氨酰自由基与R2亚基中的一个氮中心自由基（N3UDP）之间的距离变化范围。这些工作都是在不用外源标记物的情况下完成的。

近年来，EPR-SDSL技术更多地应用于研究膜结合蛋白等复杂生物大分子在溶液中的结构和运动性变化，特别是在解释蛋白质的功能细节上取得了效果。如：在研究ATP结合体ABC传运器BTuCD将VB12从胞外结合体BTuF传输至大肠杆菌胞内过程中，观察到BTuCD和BTuF的结构均发生较大的变化，与2.6 nm结晶结构相吻合[4]；流感病毒A上pH激活型质子通道M2蛋白跨膜区的38个残基和C端延伸区，在pH变化时会在膜表面形成螺旋体，距离变化信息表明其中的49位赖氨酸发挥着重要作用[2]；用EPR和NMR相结合解析膜蛋白上流感病毒融合域的结构，确定了膜外端蛋白N端对于膜融合及维持跨膜结构的重要性[20]；发现了辅酶Q氧化还原酶（呼吸复合物Ⅰ）处于膜内和膜外的两个臂的间距，在加入NADH时会加大，但对NADPH不敏感，两个臂都存在NADH依赖型的构象变化[21]；确定嵌入在脂质体中钾离子通道的压控感受器的结构[22]；在溶液状态下分析蛋白（apoA-Ⅰ）N端异构体结构[23]；通过氮氧自由基偶极间的相互作用建立蛋白的锥状空间构象模型等[24]。

某些样品中存在膜及色素等对光的传输有扰动的成分，不宜用光学方法分析，但可用EPR方法解决。如Hubbell的实验室构建出视网膜色素感光刺激后螺旋体结构的运动状态，并开展了视网膜蛋白在光驱动下的运动性和构象变化的系列应用研究[25～29]。

脉冲电子-电子双共振技术可以克服非均匀性增宽对距离测量精度的影响，提高距离测量范围，成为了新的发展方向[30]。在对人辅酶Q结构的分析中，确定多肽GA-Ⅳ在磷脂膜上的定位与聚合过程，分析膜转运蛋白质能量耦合结构的底物依赖型去折叠过程等工作，证明了这一方法的先进性[31～34]。Bennati等用脉冲DEER法研究了大肠杆菌核糖核酸还原酶在催化核酸磷酸化变为脱氧核糖双磷酸过程中，功能蛋白质的两个子结构R1和R2自由基间的相互作用和距离的变化，发现其距离变化范围可达到4.7～5 nm。这种长距离关系验证了原来的机制假设：催化过程是由自由基诱导的氨基酸通路的迁移并同时伴有较大的构象变化实现的[19]。DEER在许多方面比连续波先进，但DEER是相对昂贵复杂的系统，只有少数实验室可以开展这种实验，目前大多数实验室还只能用连续波EPR开展工作，尤其我国目前还没有脉冲双共振设备。已有的研究表明，如果问题的切入点选择得好，通过连续波EPR测量，可以做出极有价值的蛋白质结构分析工作，所以目前两种方法应用都非常广泛。

国内目前尚未建立EPR测量距离的方法，忻文娟和赵保路教授等曾用马来酰亚胺标记肿瘤细胞膜蛋白的巯基研究蛋白构象改变[34]，本实验室也曾开展过马来酰亚胺标记膜蛋白的实验研究[35]，但这些工作都要依赖于蛋白质上天然存在的巯基，难以搞清标记点在蛋白上的确切位置和数量，更无法得到不同位点之间距离的变化信息。本实验室近年来结合凝集素家族蛋白的研究，开展了定点自旋标记实验，在国内启动了用EPR-SDSL技术研究蛋白质结构与功能的工作。已在模型蛋白上成功构建了6个不同位点的半胱氨酸突变体，并实现了这些突变体蛋白的表达，目前正在开展SDSL标记和EPR分析工作。

3 问题与展望

综上可知，利用EPR-SDSL研究蛋白质的主要优势在于：测量距离范围更宽（0.5～8 nm）、测量温度范围更宽（4～＞300 K)、可以在溶液环境下测量、样品不用结晶、分子量不受限制、适合测量结构变化的动态过程等。但与其它分析方法类似，受EPR技术原理本身的限制，该方法也存在缺点：除少数自身含有自由基或顺磁性金属离子的蛋白样品以外，大多数情况需要与点突变技术配合应用。好在目前蛋白点突变已是非常成熟的技术，可以实现任意位点的突变设计；再者，有些情况下，如蛋白质本身含有功能性多半胱氨酸残基时，则难以应用；另外，任何对生物分子引入外源性探针类物质而达到测量目的的方法，都要在应用之前考虑分子的性质是否受到了不可接受的扰动，这已成为方法学研究中的主要问题。如：在X射线衍射分析中，当需要加入重金属而提高散射效果时；在荧光检测方法中需加入荧光探针时；在EPR中，当一个抗磁性金属离子被顺磁性离子所取代或加入氮氧自旋探针时,也会对生物系统的结构或活性造成一定的扰动。但许多研究表明，局部引入的自旋标记物，对蛋白的功能和稳定性的影响是很小的，有时几乎没有影响[10,36,37]。所以这种扰动带来的问题相对获得的结构信息而言还是可以接受的。

目前，在利用EPR-SDSL研究蛋白质的工作中，更注重构建蛋白质在发挥生物功能过程中其结构变化的细节，这在方法学上就要求进一步提高距离测量的准确度和精度。根据EPR波谱理论，EPR波谱线型变化除受偶极相互作用影响外，还受许多因素影响，如g因子的各向异性和原子核的超精细作用，都会使波谱产生附加的增宽效应；此外，未偶自旋间的相对取向、蛋白质整体的旋转性运动以及标记物分子的局部运动、自旋态的弛豫时间、低温测量、溶剂极性或黏性介质对分子运动的阻尼等因素，也会引起波谱线型变化。如何有效地从双自旋标记的连续波EPR波谱中准确提取距离信息一直是该领域的难题。利用单/双自旋连续波ESR波谱的去卷积运算提取出偶极作用强度，再从中计算偶极间距是目前利用连续波EPR波谱计算距离的主要方法[38]，但这种波谱去卷积方法难以完全避免上述诸因素对距离准确度的影响，而且去卷积计算和对增宽函数滤波处理等，也会引入误差和信号失真，使距离结果产生偏差。如通过构建尺寸确定的双自旋化合物作为距离测量标尺，建立不同环境下EPR波谱增宽效应与实际双基间距离的关系曲线，对实测的距离加以校验，将会改善和提高连续波EPR解析蛋白质构效关系的准确性和可信度。Jeschke曾用“炔-苯”结构为骨架的双自旋分子检验了脉冲DEER的距离测量结果，所用分子的双自旋间最小距离为1.93 nm，不适合连续波EPR方法使用。而且“炔-苯”骨架结构也可能产生折叠或扭曲，影响尺度的精准[39]。碳60和碳70（C60/C70）结构非常稳定，可以构成自由基骨架[40]，其球体结构的直径约为0.5 nm，恰在EPR测量距离的下限，如将C60分子连接形成不同长度的刚性分子链，其结构性质、尺寸范围都适合作为连续波EPR测量距离的分子标尺。除此以外，理论上“并苯”结构也是较理想的骨架结构。苯环的分子尺寸比C60更小，用并苯为骨架构建的分子标尺将比C60链的距离分辨度更高。

工欲善其事，必先利其器。应用EPR-SDSL在蛋白质等生物大分子的结构与功能关系研究中已解决了许多重要问题。与其它方法一样，尽管这一技术也存在局限性，但其在动态测量和距离测量等特有的优势，对其它技术是很好的补充。尤其在我国，利用现有EPR技术条件建立EPR-SDSL距离测量方法，可以为在溶液或生理环境下研究蛋白质的结构与功能建立新的研究方法，有利于在国内推动生物物理新技术的应用与发展。

1. Berliner LJ,Eaton GR,Eaton SS.Distance measurements in biologicalsystems by EPR. New York： Kluwer Academic/Plenum Publisher,2000.12～21

2. Nguyen PA,Soto CS,Polishchuk A,Caputo GA,Tatko CD,Ma Cl,Yu K,Ohigashi LHP,Degrado WF,Howard KP.pH-induced conformational change of the influenza M2 protein C-terminal domain. Biochemistry，2008，47(38)：9934～9936

3. Fanucci GE,Cafiso DS.Recent advances and applications of site-directed spin labeling.Curr Opin Struct Biol，2006,16(5)：644～653

4. Hvorup RN,Goetz BA,Niederer M,Hollenstein K,Perozo E,Locher KP.Asymmetry in thestructureof theABC transporter-binding protein complex BtuCD-BtuF.Science,2007,317(5843)：1387～1390

5. Dong J,Yang G,McHaourab HS.Structural basisof energy transduction in the transportcycle ofMsbA.Science,2005,308(5724)：1023～1028

6. Borbat PP,Costa-Filho AJ,Earle KA,Moscicki JK,Freed JH.Electron spin resonance in studies of membranes and proteins.Science,2001,291(5502)：266～269

7. Perozo E,Cortes DM,Sompornpisut P,Kloda A,Martinac B. Open channelstructure ofMscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.Nature,2002,418：942～948

8. Steinhoff HJ.Inter-and intra-molecular distances determined by EPR spectroscopy and site-directed spin labeling reveal protein-protein and protein-oligonucleotide interaction. Biol Chem,2004,385(10)：913～920

9. Hubbell WL,Altenbach C.Investigation of structure and dynamicsin membrane proteins using site directed spin labeling.Curr Opin Struct Biol,1994,4：566～573

10.Hubbell WL,Cafiso DS,Altenbach C.Identifying conformational changeswith site-directed spin labeling.Nat Struct Biol,2000,7(9)：735～739

11.Voss J,Hubbellt WL,Kaback HR.Distance determination in proteins using designed metal ion binding sites and site-directed spin labeling： application to the lactose permease ofEscherichia coli. Biochemistry，1995，92：12300～12303

12.Sompornpisut P,Liu YS,Perozo E.Calculation of rigidbody conformational changes using restraint-driven cartesian transformations.Biophysical J,2001,81：2530～2546

13.Dong J,Yang G,McHaourab HS.Structural basisof energy transduction in the transportcycle ofMsbA.Science,2005,308(5724)：1023～1028

14.Chiang YW,Borbat PP,Freed JH.The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.J Magn Reson,2005,172(2)：279～295

15.Mehboob S,Luo BH,Fu W,Johnson ME,Fung LW.Conformational studies of the tetramerization site of human erythroid spectrin by cysteine-scanning spin-labeling EPR methods.Biochemistry,2005,44(48)：15898～15905

16.Ueki S,Nakamura M,Komori T,Arata T.Site-directed spin labeling electron paramagnetic resonance study of the calcium-induced structural transition in the N-domain of human cardiac troponin C complexed with troponin I.Biochemistry,2005,44(1)：411～416

17.Lietzow MA,Hubbell WL.Motion of spin label side chains in cellular retinol-binding protein：correlation with structure and nearest-neighbor interactions in an antiparallel beta-sheet.Biochemistry,2004,43(11)：3137～3151

18.Kay CWM,Elsasser C,Bittl R,Farrell SR,Thorpe C.Determination ofthe distance between the two neutral flavin radicals in augmenter of liver regeneration by pulsed ELDOR.J Am Chem Soc,2006,128：76～77

19.Bennati M,Robblee JH,Mugnaini V,Stubbe J,Freed JH,Borbat P.EPR distance measurements support a model for long-range radical initiation inE.coliribonucleotide reductase.J Am Chem Soc,2005,127：15014～15015

20.Tamm LK,Lai AL,Li YL.Combined NMR and EPR spectroscopy to determine structures of viral fusion domainsin membranes. Biochim BiophysActa，2007,1768(12)：3052～3060

21.Pohl T,Schneider D,Hielscher R,Stolpe S,Dörner K,KohlstädtM，BöttcherB，Hellwig P，Friedrich T.Nucleotide-induced conformational changes in the Escherichia coliNADH：ubiquinone oxidoreductase(complex I).Biochemical Society Transactions,2008,36：971～975

22.Vamvouka M,Cieslak J,van Eps N,Hubbell WL,Gross A.The structure of the lipid embedded potassium channel voltage sensor determined by double-electron-electron resonance spectroscopy.Protein Sci,2008,17(3)：506～517

23.Lagerstedt JO,BudamaguntaMS,OdaMN,VossJC.Electron paramagnetic resonance spectroscopy of site-directed spin labels reveals the structural heterogeneity in the N-terminal domain of apoA-I in solution. J Biol Chem,2007,282(12)：9143～9149

24.Hustedt EJ,Stein RA,Sethaphong L,Brandon S,Zhou Z,Desensi SC.Dipolar coupling between nitroxide spin labels：the development and application of a tether-in-a-cone model.Biophys J,2006,90(1)：340～356

25.Altenbach C,Kusnetzow AK,Ernst OP,Hofmann KP,Hubbell WL.High-resolution distance mapping in rhodopsin reveals the pattern of helix movement due to activation.Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(21)：7439～7444

26.Knierim B,Hofmann KP,Gartner W,Hubbell WL,Ernst OP.Rhodopsin and 9-demethyl-retinal analog：effect of a partial agonist on displacement of transmembrane helix 6 in class A G protein-coupled receptors.J Biol Chem,2008,283(8)：4967～4974

27.Sasaki J,Phillips B,Chen X,van Eps N,Tsai AL,Hubbell WL,Spudich J.Different dark conformationsfunction in color-sensitive photosignaling by the sensory rhodopsin I-Htrl complex.Biophys J,2007,92：4045～4053

28.Hanson S,van Eps N,Francis D,Vishnivetskiy S,Klug C,Hubbell WL,Gurevich V.Structure and function of thevisual arrestin oligomer.EMBO J,2007,26：1726～1736

29.Knierim B,Hofmann KP,Ernst OP,Hubbell WL.Sequence of late molecular events in the activation of rhodopsin.Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(51)：20290～20295

30.Jeschke G,Polyhach Y.Distance measurements on spinlabelled bio-macromoleculesby pulsed electron paramagnetic resonance.Phys Chem Chem Phys,2007,9(16)：1895～1910

31.Hara H,Tenno T,Shirakawa M.Distance determination in human ubiquitin by pulsed double electron-electron resonance and double quantum coherence ESR methods.J Magn Reson,2007,184(1)：78～84

32.Salnikov ES,Erilov DA,Milov AD,Tsvetkov YD,Peggion C,Formaggio F,Toniolo C,Raap J,Dzuba SA.Location and aggregation of the spin-labeled peptide trichogin GA IV in a phospholipid membrane as revealed by pulsed EPR.Biophys J,2006,91(4)：1532～1540

33.Xu Q,Ellena JF,Kim M,Cafiso DS.Substrate-dependent unfolding of the energy coupling motif of a membrane transportprotein determined by double electron-electron resonance.Biochemistry,2006,45(36)：10847～10854

34.忻文娟,赵保路,张建中.中国地鼠肺正常细胞V_(79)和癌变细胞V_(79)-B_1膜上巯基结合位置的性质.中国科学(B辑),1984,14(5)：429～435 Xin WJ,Zhao BL,Zhang JZ.Science in China(Series B),1984,14(5)：429～435

35.王长振，丛建波，先 宏，曹晓哲，孙存普，吴 可.电磁脉冲对大鼠肝脏线粒体膜流动性及脂质过氧化的影响.中华劳动卫生职业病杂志，2002，20(4)：266～268 Wang CZ，Cong JB，Xian H，Cao XZ，Sun CP，Wu K.The effects of electro-magnetic pulse on fluidity and lipid peroxidation of mitochondrial membrane.Chin J Ind Hyg Occup Dis,2002,20(1)：266～268

36.Langen R,Oh KJ,Cascio D,Hubbell W.Crystal structure of spin labeled T4 lysozyme mutants：implications for the interpretation of EPR spectra in terms of structure.Biochemistry,2000,39：8396～8405

37.Hubbell WL,Gross A,Langen R,Lietzow MA.Recent advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol,1998,8(5)：649～656

38.Rabenstein MD，Yeon KS.Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92：8239～8243

39. Jeschke G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.Chemphyschem,2002,3：927～932

40.Li YL,Xu JH，Zheng DG,Yang JK,Pan CY,Zhu DB.Synthesisand characterization of stable nitroxides based on fullerenes(C60，C70)and their magnetic study.Solid State Communication,1997,101(2)：123～128

This work was supported by grants from The National Natural Science Foundation of China(30970693,30750009),the Innovation Method Fund of The Ministry of Science and Technology of China(2008IM022000)

Technique and Application of Distance Measurement between Selected Points in Protein Molecule by EPR

WU Ke
Beijing Institute of Radiation Medicine,The Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China

Oct 10,2009 Accepted：Jan 14,2010

WU Ke,Tel：+86(10)66931249,E-mail：wuk315@163.com

The properties and biological functions of protein depend on its structure.Structure determination is strongly dependent on accurate measurement of distance between selected sites in protein.The principle distance measurementby EPR between uncoupled spins was introduced. Furthermore，progress in site-directed spin labeling(SDSL)EPR technique applied in protein structure and function research,was reviewed.

EPR;SDSL;Distance measurement;Protein structure

2009-10-10；接受日期：2010-01-14

国家自然科学基金项目(30970693，30750009)，国家科技部创新方法专项课题(2008IM022000)

吴可，电话：(010)66931249，E-mail：wuk315@163.com

Q6-33