高效液相色谱法同时检测食品中脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精钠的含量

梁 可，黄惠敏

洛阳市质量技术监督检验测试中心，河南洛阳 471003

脱氢乙酸是一种在酸性、碱性条件下均有效的广谱型防腐剂。其钠盐易溶于水，添加到食品当中在不影响食品口味的情况下，能够起到防腐、防霉、杀菌保鲜的作用，又因其在人体新陈代谢过程中逐渐分解为乙酸，对人体无毒，更是得到了食品加工行业的青睐。但目前，脱氢乙酸的安全性受到质疑，我国台湾省、日本、美国都在各类食品中规定了最大允许使用量，我国在一定范围内允许其使用，但最大允许使用量限定为300ug/mL。

我国检测食品中脱氢乙酸的传统方法为气相色谱法，近年来高效液相色谱法也已经被广泛研究，但均只能对该单一物质进行检测，并使用二极管阵列检测器进行检测。而各级食品监管部门在对食品质量的监督抽查中，还会涉及到对诸如传统防腐剂山梨酸、苯甲酸，甜味剂糖精钠等食品添加剂的检测。如果沿用国家标准逐一分开检测，不但增加了工作成本，而且降低了工作效率。本方法探讨了用高效液相色谱法紫外检测器同时对脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精钠进行检测，更快速，更高效。

1 材料和方法

1.1 主要仪器及试剂

液相色谱仪：Waters 1525 型，配有紫外检测器；离心机：10 000r/min，TGL-16A高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；甲醇：色谱纯，TEDIA COMPANY；乙酸铵：优级纯，广州化学试剂厂；碳酸氢钠：优级纯，科密欧试剂；紫外可见分光光度计：TU-1810，北京谱析通用仪表有限责任公司。

1.0mg/mL 脱氢乙酸标准溶液：精确称取脱氢乙酸标准物质0.100g，加碳酸氢钠（20g/l）5mL，微热溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL，作为储备溶液4℃保存。

1.0mg/mL 山梨酸标准溶液：精确称取山梨酸标准物质0.100g，加碳酸氢钠（20g/L）5mL，加热溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL，作为储备溶液。

1.0mg/mL 苯甲酸标准溶液：精确称取苯甲酸标准物质0.100g，加碳酸氢钠（20g/L）5mL，加热溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL，作为储备溶液。

1.0mg/mL 糖精钠标准溶液：精确称取0.0851g 经120℃烘干4h 后的糖精钠，加水定容至100mL，作为储备溶液。

脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精钠标准混合使用液：取脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精钠标准储备溶液各10.0mL，放入100mL 容量瓶中，加水至刻度。此溶液含脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、糖精钠各0.1mg/mL。可根据需要稀释成不同浓度，经0.45um 滤膜过滤。

1.2 样品处理

称取均匀化的试样2.5g，加水定容至25.0mL。超声提取10min，转入离心管中，5 000r/min 离心10min。取上层清液0.45um 滤膜过滤。蛋白质含量高的样品在定容前需加人少量亚铁氰化钾及乙酸锌以沉淀蛋白质，以下操作同上

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18(2) 5um 4.6×250mm；

流动相：甲醇-乙酸铵溶液（0.02mol/L）（5:95）；

流速：1.0mL/min；

进样量：10uL；

检测器：紫外检测器，230nm 波长。

按上述色谱条件，采用外标法，以保留时间定性，峰面积定量，测得样液中脱氢乙酸浓度（mg/L）。

1.4 结果计算

样品中脱氢乙酸含量（g/kg）=C×V×10-3/m

式中，C 为样品中脱氢乙酸浓度（mg/L），V 为样液体积（mL），m 为样品质量（g）。

2 结果与讨论

2.1 样品的提取

防腐剂、甜味剂都是以易溶于水的盐的形式添加到食品当中的，所以本方法采用直接用水溶解样品并加以提取，既保证了高回收率，又能减少使用有机物方法提取的污染，还节约了成本。

2.2 检测波长的选择

利用紫外分光光度计对脱氢乙酸钠标准溶液进行全波长扫描，见图1，发现最大吸收波长在290nm和230nm 处。因为山梨酸、苯甲酸、糖精钠在230nm 处也有明显的吸收，为便于同时检测，我们选择230nm 作为检测波长。

图1

2.3 流动相的选择

在反相C18 柱中最常见的流动相为甲醇-乙酸铵溶液（0.02mol/L）系统。两者比例的大小，直接影响到出峰时间和峰形对称性。本方法经过反复试验发现：当甲醇-乙酸铵溶液（0.02mol/l）体积比为5:95时，4种待测物质有较好的分离度。而且整体出峰时间靠后，有效的避开了杂质峰的干扰。

2.4 色谱分离及线性实验

在1.3 色谱条件下测定，山梨酸、苯甲酸、糖精钠、脱氢乙酸（钠）的保留时间分别为10.04min、13.64 min、18.13 min、19.92 min。峰形及组分分离效果均较好。以各组分的浓度与对应色谱峰面积有良好的线形关系，线形相关系数山梨酸为0.9993、苯甲酸为0.9995、 糖精钠为0.9995、脱氢乙酸为0.9966。

2.5 重现性及回收率

序号加标量/（ug/ml）检测结果/（ug/ml）平均值/（ug/ml） 标准偏差 回收率/%1 0 15.233 2 0 15.893 3 0 16.021 4 10.0 15.716 0.42 /25.346 5 25.814 0.41 101.0%35.223 25.994 6 26.102 7 20.0 8 35.153 0.06 97.2%45.867 35.120 9 35.116 10 30.0 11 46.101 12 46.231 46.066 0.18 101.2%

分别称取同一样品（n=3），按本方法加标测定，结果见表，加标回收率为97.2%～101.2%，平均回收率为99.8%。见表1。

2.6 检出限

检出限为最低相应值（3 倍仪器噪音水平）与绝对相应值的比值。经实验证明，该法检测脱氢乙酸的色谱法检出限为0.25ug/ml，比用293nm 波长检测脱氢乙酸色谱法检出限低2 倍左右。山梨酸、苯甲酸、糖精钠因沿用GB/T5009.29-2003的方法条件，这里不再累述。

3 结论

食品添加剂的检测，一直以来都是各个检测机构重要的检测项目。近年来，利用高效液相色谱法检测脱氢乙酸的研究也逐步趋向成熟化，同时检测脱氢乙酸、苯甲酸、山梨酸等食品添加剂的方法也有研究和报道，但多是采用二极管阵列检测器（DAD）进行检测，由于检测设备昂贵，许多中、低水平的检验机构都无法普及。本方法采用紫外检测器，对上述的4种添加剂同时作出检测，大大降低了检验成本，并且通过改变检测波长提高了脱氢乙酸的检出灵敏度，方法更加简便、快捷。但笔者也反复试验，希望通过调整流动相PH 以改善脱氢乙酸峰拖尾的问题。但因条件有限为能达成。希望有条件的单位能够完成。

[1]王竹天.食品卫生检验方法（理化部分）注解（上、下）.中国标准出版社.

[2]GB/T23377-2009 食品中脱氢乙酸的测定高效液相色谱法.