运动训练对脑缺血再灌注后内皮祖细胞的影响

赵 平,黄诚胤,聂 涛

(1.重庆大学体育学院,重庆 400044;2.成都电子机械高等专科学校,四川 成都 610031)

运动训练对脑缺血再灌注后内皮祖细胞的影响

赵 平1,黄诚胤1,聂 涛2

(1.重庆大学体育学院,重庆 400044;2.成都电子机械高等专科学校,四川 成都 610031)

目的:研究运动训练对大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型后外周血中 EPCs数量的影响。方法:雄性 SD大鼠参照Longa的方法改进,建立MCAO模型。将MCAO后小鼠随机分为4组①正常对照组(同步饲养);②假手术对照组;③手术对照组;④手术 +运动训练组,每组均 18只鼠。结果:经过缺血再灌注损伤后,手术对照组大鼠外周血 EPCs数量明显升高,手术 +运动组外周血中 EPCs数量在几个时间点中呈现先上升后又降低的趋势,表现为 2天数量与正常组并无差异,而 6天数量明显上升,高于其他各组,12天数量又出现降低。结论:运动训练可增加大鼠MCAO后外周血 EPCs的数量,运动对促进 EPCs动员和归巢的调节作用,可以减缓由于脑缺血损伤导致的危害。

运动训练;脑缺血再灌注损伤;内皮祖细胞;血管新生

脑梗塞是一种高发病率、高致残率和高死亡率的疾病,给家庭和社会带来非常沉重的经济负担。它与恶性肿瘤及心脏病稳居人类死亡原因的前三名,严重危害人类健康[1]。因此,积极探索对其切实有效的治疗方法具有十分重要的社会和现实意义。国内外已有研究成果,脑缺血损伤能够启动血管新生修复机制,同时运动训练后可以促进脑缺血的血管新生和预后。但是运动训练作为一种物理治疗方法,其治疗机制是复杂的。近年来,应用康复训练治疗急性缺血性脑血管疾病取得了良好的疗效,大量动物实验与临床研究也针对其治疗机理进行了探索,积累了不少经验成果[2]。本研究从 EPCs(endothelialprogenitor cells),这一和血管新生修复关系密切的干细胞入手,先对大鼠骨髓中 EPCs进行分离、培养和鉴定,将结果作为理论依据,并以不同处理后大鼠的外周血作为研究对象,探讨在运动训练刺激影响下脑缺血再灌注大鼠外周血中内源性 EPCs数量的变化,为康复医学在促进血管新生方面机理研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

主要试剂与动物:M199培养液 (HyClone,U.S. A),胎牛血清 FBS(HyClone,U.S.A),Percoll分离液(Pharmacia,U.S.A),山羊抗大鼠 CD31抗体(Santacruz,U.S.A),小鼠抗大鼠 VE-cadherin抗体(Santacruz,U.S.A),PBS缓冲液 (北京中杉金桥生物技术有限公司),青霉素 (北京鼎国生物),链霉素 (北京鼎国生物),Dil-标记的乙酰化低密度脂蛋Dil-Ac -LDL(Biomedical Technologies,U.S.A),FITC-标记的荆豆凝集素 FITC-UEA-1(Sigma,Ger many)。健康成年 SD(Sprague-Dawley)大鼠,雄性,体重(250±30)g,清洁级,重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2 骨髓单个核细胞的分离及 EPCs的培养及鉴定

选用健康清洁级雄性 SD大鼠进行颈椎脱臼法处死。准备好两套已消毒的手术器械,用第 1套器械除去大鼠双下肢腿部的皮肤,然后在尽量保持大鼠双股骨和胫骨完整性的条件下,剪下大鼠双下肢,并将剪下的股骨胫骨置于已消毒并盛有含双抗溶液的 PBS缓冲液的烧杯中,转移置于超净工作台上,并再用含双抗溶液的 PBS缓冲液冲洗约 2-3次。然后在无菌条件下,用第 2套器械处理股骨胫骨上残留的肌肉,用剪刀分别剪去股骨胫骨的两端,暴露骨髓腔,在培养皿中加入约 5ml的含 10%胎牛血清的M199培养基,用注射器从培养皿中吸取培养基,吹洗骨髓腔,直至骨髓腔内细胞被吹出,骨髓腔变白。用吸管将培养皿中的细胞悬液吹打混匀,然后将悬液装入离心管中离心 5min(1 000r/min),去上清液和脂肪层,取沉淀加入含 10%胎牛血清的M199培养基制成细胞悬液,充分混匀,然后将悬液贴壁缓缓加入到预置有等体积 Percoll分离液(1.077g/ml)的离心管中(分离液应放置于 4℃冰箱储存,在实验时提前取出,避光平衡至室温),悬于上层, 2500r/min离心 20 min,管内液体分为 4层,收集处于中部的云雾状白膜层的单个核细胞于另一离心管中,用含 10%胎牛血清的 PBS缓冲液洗涤两次,每次 1 500r/min,离心 10min弃去上清液。最后分别用诱导组M199培养液和对照组M199培养液重悬细胞。以2×104/cm2种植密度分别接种于预先有 Fn包被的24孔培养板中,置于 5%CO2,饱和湿度,37℃,pH7.2恒温培养箱中孵育培养,并于 3d后首次换液。用倒置显微镜观察细胞的形态、生长情况。

1.3 动物分组与制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO)

采用完全随机设计的方法,将大鼠随机分为四组,每组 18只。①正常对照组(同步饲养);②假手术对照组;③手术对照组;④手术 +运动训练组。采用血管内线栓法阻断 SD大鼠大脑中动脉血流,参照Longa[3]等建立的方法有所改进,建立缺血 -再灌注模型。由颈总动脉近分叉处插入栓子改为由颈外动脉插入栓子,拔出栓子后不影响颈内动脉血供,更有利于大脑中动脉供血区血流的恢复。大鼠在造模手术清醒后1-2h内即开始依据 Zealonga等确定的 5级评分方法进行神经功能评分:0分,正常活动;1分,不能充分伸展右前肢;2分,向右侧转圈;3分,向右侧倾倒;4分,不能自发行走,意识障碍。将模型成功(2-3分)的大鼠用于实验。

1.4 跑台训练

所有手术 +运动组大鼠在造模前经历 5-8m/ min、30min/d、2天的适应性跑台训练[4]。动物再灌注后 24小时,手术 +运动组予以跑台 (型号:DSPT-202,立泰生物科技有限公司)训练:坡度 0.12m/min,每天 30min,每周 5天,连续训练 2周。对假手术对照组和手术对照组大鼠进行同样抓取,但不进行跑台干预。

1.5 流式细胞术检测外周血 EPCs数量

将外周血经红细胞裂解液处理后,用 0.5%BSA -PBS制成单细胞悬液。吸取 100μl细胞悬液 (细胞浓度≥1×106个/ml)。加入 10μl FITC标记的小鼠抗大鼠 CD31抗体,同时非特异 IgG作为同型对照,室温避光孵育 20 min。用 0.5%BSA-PBS洗涤 1-2次,洗掉未结合的抗体。VEGFR-2的检测采用二抗间接标记进行。先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入 PE标记的第二抗体,生成抗原 -抗体 -抗抗体复合物,用 0.5%BSA-PBS洗涤 1-2次,加入缓冲液重悬,4%多聚甲醛固定后,流式细胞仪检测。检测出的VEGFR-2及 CD31表达双阳性的细胞,即被标记为 EPCs。

1.6 结果统计学分析

2 实验结果与分析

2.1 细胞形态学变化

在倒置显微镜下可见,第 7d左右,出现 EPCs典型形态特征 --“集落”样结构 (图 1)。集落中央为圆形细胞群,周边有梭形细胞伸展,并与其他细胞相连接,与原始血岛相似。

图 1 细胞诱导培养 7d后,倒置显微镜观察到的集落形态(×40)

2.2 细胞表型分析

细胞被诱导培养 7d后,激光扫描共聚焦显微镜显示(图 2):DAPI蓝染的细胞核 (图 2A)、VE-cadherin +细胞 (图 2B)、CD31+细胞 (图 2C)以及 VE-cadherin+CD31+黄褐色双荧光细胞 (图 2D)。黄褐色双荧光细胞表型符合 EPCs的表型特征。CD31+黄褐色双荧光细胞(D)

图 2 激光扫描共聚焦显微镜观察显示:DAPI染细胞核(A)、VE-cadherin+细胞 (B)、CD31+细胞 (C)、VE-cadherin+

2.3 外周血中 EPCs数量的变化

不同分组的大鼠外周血中 EPCs的数量存在差异,并随时间的变化产生波动。假手术对照组 EPCs的数量与该时间点正常组的 EPCs的数量差异不明显,无统计学意义;手术对照组在 2d时外周血中 EPCs数量明显升高,与手术 +运动组及其他各组相比变化差异极其显著(P<0.01),而此时手术 +运动组与正常组和假手术对照组值无明显差异;6d时,手术 +运动组 EPCs数量上升,与手术对照组相比变化差异显著(P<0.05),有统计学意义,且与正常组、假手术对照组相比差异极其显著 (P<0.01);12d时,手术 +运动组值下降,与正常组和假手术对照组比差异不明显,无统计学意义,手术对照组与各组相比数值仍较高,差异极其显著(P<0.01)。详见表 1。

表 1 各组不同时间外周血中 EPCs所占的百分比(每时间点取样

表 1 各组不同时间外周血中 EPCs所占的百分比(每时间点取样

注:与正常组比较显著差异＊＊P<0.01;与假手术对照组同期比较显著差异▲▲P<0.01;与手术对照组同期比较显著差异△P<0.05,△△P<0.01

3 结论

脑缺血会导致供血不足,而损伤部位的血管新生可以增加脑血流量,减少缺血损伤。有研究表明脑缺血等原因造成的脑损伤可能启动血管生成机制。血管生成 (angiogenesis)存在两种形式,一种称为血管发生,由血管干细胞原位分化为血管内皮干/祖细胞及内皮细胞后形成新生血管;另一种称为血管重生,从原来存在的血管基础上通过出芽等形式生出新的,以毛细血管为主的血管系统的过程[5]。在血管新生的理论基础上诞生出血管新生疗法已成为治疗包括动脉粥样硬化、恶性肿瘤、心肌缺血等“血管生成相关疾病”(angiogenesis dependent diseases)[6]的重要方案[7]。该种方法的临床实验已有数十年历史。起初研究是从生长因子基因导入的治疗性血管新生。而目前大量研究表明缺血性损伤修复与干细胞的迁移、增生、分化有着密切的关系,因此研究又进入 EPCs等干细胞移植的治疗性血管形成阶段。Asahara等[8]1997年首次报道在成人外周血单核细胞中分离出内皮祖细胞。内皮祖细胞不仅在胚胎阶段参与血管发生,而且在出生后通过动员、迁移和分化等过程参与新生血管生成,在成体新生 血管中内皮祖细胞来源的内皮细胞占到25%[9]。

有研究显示,骨髓 CD34-/VE-cadherin-/ CD133+/KDR+多潜能成年祖细胞是内皮祖细胞的来源。骨髓中的内皮祖细胞经各种因素刺激后向外周血迁移,增加外周血中的内皮祖细胞的数量,称为内皮祖细胞的动员 (Mobilization)。在生理状态下,外周血液中内皮祖细胞的数量很少。在缺血损伤后,骨髓中的内皮祖细胞可经动员进入外周循环,归巢到缺血部位,从而促进缺血组织的血管新生[10],并可以通过分化为成熟内皮细胞进行循环、增殖,参与血管网的形成[11]。国内临床研究证明康复训练可减轻梗死造成的脑组织结构和功能的损伤,改善脑梗塞患者的功能[12-13],运动训练是康复医学治疗方法中的重要手段。近年来,越来越多的学者将目光转移到了运动训练在脑损伤中的机制研究。孙莉敏研究中[14],对MCAO大鼠进行跑台训练,2周后运动组脑梗死体积明显小于对照组,同时进行了血管生成素检测,手术加运动组血管生成素表达明显高于假手术组和手术对照组,血管生成素的增高提示运动训练很有可能促进脑组织的血管生成。李玲等[15]对脑梗死大鼠进行抓握、平衡、旋转、行走等训练,并用免疫组化方法标记细胞核抗原(PCNA),检测细胞增生情况。发现在早期脑梗死大鼠梗死灶周围可见胶质细胞增生及周边散在的小血管芽向坏死区生长并形成胶质瘢痕,后期边缘有明显的血管和纤维母细胞增生,在梗死灶内有肉芽和血管支架形成。

大量的研究数据证明:对脑缺血大鼠进行一定强度的运动训练可以明显改善大鼠的运动功能并减小脑梗死体积。但是有关运动训练对骨髓 EPC动员到外周血的实验研究目前见到的文献报道较少,不同强度的运动训练是否能引起脑缺血后 EPC数量及活性表达发生不同的变化?目前尚未见到类似的研究报道。本研究选取大鼠中动脉闭塞 -再灌注模型作为研究缺血性脑血管病的基础模型,对MCAO大鼠进行跑台训练,并根据时间点对模型抽取外周血通过流式细胞术检测 EPC数量。经过缺血再灌注损伤后,手术对照组大鼠外周血 EPCs数量明显升高,以 2d为峰值,6d、12d较 2d有所降低且 6d与 12d之间无统计学差异;而手术 +运动组外周血中 EPCs数量在几个时间点中呈现先上升后又降低的趋势,表现为 2d数量与正常组并无差异,而 6d数量明显上升,高于其他各组,12d数量又出现降低。手术对照组外周血中 EPCs出现上述变化与已有研究报道一致:在生理条件下,循环系统中EPCs仅占全部 PBMC的 0.03%～0.06%。在缺血损伤后,骨髓中的 EPCs可经动员进入外周循环,归巢到缺血部位,促进缺血组织的血管新生[16]。Asahara等发现在烧伤或冠状动脉旁路手术后 6-12h外周血中 EPCs水平增加近 50倍,在 48-72h后逐渐降至基线水平[17]。同时也有研究表明,脑缺血损伤初期还伴有炎症反应,并在 24h到达高峰[18]。可见,手术对照组外周血中 EPCs在 2d时的突增可能还与损伤造成的炎症反应有关。而模型组 6d和 12d较 2d数值虽有所降低,但仍处于较高状态,推测可能与脑缺血产生的持续损伤和炎症反应有关。手术 +运动组外周血中EPCs数量的变化趋势与手术组存在着明显差异。本研究对运动训练调节外周血中循环 EPCs的机制作如下推测:运动训练对 EPCs的调节作用可能与其可以减缓由于脑缺血损伤导致的炎症反应和提高外周血血清中各种生长因子的含量有关。从而,在多因素的共同作用下,运动作用促进 EPCs的动员和归巢。但运动训练的强度和内容调节内源性 EPCs的确切机制尚不明确,因此,还应从这些方面进行深入的研究,为临床康复训练治疗脑梗塞奠定实验基础。

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Effect of Exercise Tra in ing on Cerebral Ischem ia-Reperfusion Injury of Endothelial Progen itor Cells

Zhao Ping et al
(Physical Education School,ChongqingUniversity,Chongqing 400044)

Objective:To study of the impact on the number of EPC in peripheral blood aftermovement training on middle cerebral artery occlusion(MCAO)and reperfusion model.Methods:Male SD rats with reference to Longa’s method improved the establishment ofMCAO models.TheMCAO mice were randomly divided into 4 groups①nor mal control group(synchronous breeding);② sham-operated control group;③operation control group;④operation+ exercise training group,all 18 mice in each group.Campaign Group:Treadmill Training for 2 weeks.MCAO, respectively,after 2d,6d,12d,the number of rat peripheral blood EPC changes.Results:After ischemia-reperfusion injury,surgical control rats significantly increased the number of peripheral blood EPCs with 2d as the peak,6d,12d somewhat lower than the 2d and 6d and 12d witnessed no significant statistical difference;while in the surgery+ exercise group,the number of EPCs in peripheral blood of several time point showed the tendecy of first rising followed by falling,the number of 2d showed no difference with the nor mal group,while the marked increase appeared in the number of 6d,which was higher than the other groups,but dropped in the number of 12d.Conclusion:The exercise training can increase the EPC in peripheral blood cells in rats afterMCAO and the number of sports can stimulate EPC mobilization and homing;,thereby to slow down the har m caused by cerebral ischemia.

exercise training,cerebral ischemia,endothelial progenitor cells,blood vessels renewal

Document code:A

1001—9154(2010)07—00

book=67,ebook=127

G804.2

A

1001—9154(2010)07—0067—05

国家自然科学基金(10872224);中央高校基本科研业务费资助(项目编号:CDJSK100092)。

赵平(1974-),男,重庆人,讲师,研究方向为运动人体科学。

2010—06—09