参七虫草胶囊对肺纤?维化大鼠TGF-β1mRNA表达的影响*

张念志 许祥稳 李国琳 陈 炜 师董芳 刘光明

1 安徽中医学院第一附属医院（合肥 230031）

2 安徽中医学院硕士生（合肥 230031）

参七虫草胶囊对肺纤?维化大鼠TGF-β1mRNA表达的影响*

张念志1许祥稳2李国琳1陈 炜1师董芳2刘光明2

目的探讨参七虫草胶囊对肺纤维化大鼠TGF-β1mRNA表达的影响。方法采用博莱霉素致肺纤维化大鼠模型，大鼠处死后分离大鼠肺组织，应用RT-PCR半定量及图像分析方法，对空白组、模型组、参七虫草胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组及泼尼松组大鼠肺组织TGF-β1mRNA表达水平进行观察。结果参七虫草胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组及泼尼松组大鼠肺组织TGF-β1mRNA表达水平明显低于模型组。结论参七虫草胶囊高、中、低剂量及泼尼松均可调控博莱霉素致肺纤维化大鼠TGF-β1mRNA表达水平，从而减轻肺纤维化的程度。

参七虫草胶囊 肺纤维化 转化生长因子-β1逆转录聚合酶链反应

1 安徽中医学院第一附属医院（合肥 230031）

2 安徽中医学院硕士生（合肥 230031）

*安徽省教育厅自然科学研究项目（No.2004kj262）

肺纤维化是以细胞外基质 （ECG）的沉积为主要特征的疾病，其起病隐袭，主要症状为进行性呼吸困难，常有干咳、少痰，咳嗽可呈阵发性，止咳药效果不佳。转化生长因子-β（TGF-β）最初是从血小板中分离出来的一种细胞因子,因其能促进成纤维细胞转化生长而得名;TGF-β主要来源于巨噬细胞、上皮细胞和成纤维细胞,是一组多功能的调节细胞生长和分化的细胞因子。肺脏是富含TGF-β的器官之一,肺纤维化直接与TGF-β的过度表达，ECG的过度积累有关。体外实验Western印记分析表明,BLM鼠肺纤维母细胞用TGF-β1抗体孵化后,以剂量依赖的方式抑制博莱霉素诱导的TG-β1大量释放和蛋白多糖的表达[1]。本实验从分子生物水平出发，应用RT-PCR方法分析参七虫草胶囊对博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1mRNA表达的影响[2]，从基因水平探讨TGF-β1在肺纤维化中的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）实验动物：取健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，清洁级，购于南京医科大学动物实验中心[生产许可证号SCXK（苏）2002-0031]。（2）治疗药物：醋酸泼尼松片[上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂产品]，参七虫草胶囊 （每粒0.4g）由西洋参、参三七、冬虫夏草3味药物按照1∶1∶1比例制成胶囊（安徽中医学院第一附属医院制剂中心提供）。实验时用蒸馏水将参七虫草胶囊配成所需浓度的混悬液[3]。（3）注射用盐酸博莱霉素 （日本化药株式会社），DEPC（Amresco），TRIZOL（Invitrogen），异丙醇、三氯甲烷、无水乙醇（国药集团），RT-PCR试剂盒（Promega，100T），Taq 酶（Promega），dNTP（Promega），DNA Marker（DL2000）（TaKaRa），琼脂糖（西班牙），冰乙酸、溴化乙锭（EB，Amresco）。（4）仪器：台式冷冻高速离心机、台式高速离心机（德国Eppendorf），UV-754紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂），FA1104型电子天平（上海衡平仪器厂），电泳仪（美国BIO-RAD公司），水平电泳槽（美国BIO-RAD公司），精密数显酸度计 （上海天达仪器有限公司），三洋-80℃低温冰柜（SANYO公司），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），ATC 201型PCR扩增仪（美国APPOLO公司），温度梯度基因扩增仪（德国MIONETRA），托盘天平（上海第二天平仪器厂），凝胶成像系统（江苏省捷达科技发展有限公司），漩涡混匀器（太仓市科教器材厂），UPK-I-10纯水机（成都超纯科技有限公司），数显三用水浴箱（江苏省金坛荣华仪器制造有限公司）。（5）引物：引物设计根据Genbank,采用Prime5软件设计，由上海生物工程公司合成。TGF-β1（332bp）上游为 5′-TAATGGTGGACCGCAACAAC-3′，下游为 5′-GTGAGCACTGAAGCGAAAGC-3′;β -actin（513bp）上游为 5′-TGTGATGGTGGGTATGGGTAC-3′，下游为 5′-TTAATGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.2 实验方法 取Wistar大鼠60只，雌雄各半，随机分为空白对照组、肺纤维化模型组、参七虫草胶囊高剂量组、参七虫草胶囊中剂量组、参七虫草胶囊低剂量组、醋酸泼尼松组，每组10只。各组大鼠自由摄食饮水，除空白对照组大鼠不加处理外，其余5组大鼠均采用博莱霉素气管内滴注造模，应用3.6%水合氯醛（1mL/100g体重）麻醉大鼠，切开气管，应用博莱霉素（0.5mg/100g体重）气管内滴注。造模后24h参七虫草胶囊低剂量组予以参七虫草胶囊0.025g·100g-1·d-1灌胃，参七虫草胶囊中剂量组予以参七虫草胶囊0.035g·100g-1·d-1灌胃，参七虫草胶囊高剂量组予以参七虫草胶囊0.07g·100g-1·d-1灌胃[4]，泼尼松组予以0.6mg·100g-1·d-1灌胃，模型组及空白组继续自由摄食饮水。造模成功后1个月处死动物，采取肺组织标本，储存于-80℃冰箱。

1.3 肺组织TGF-β1mRNA表达测定 取50～100mg肺组织于匀浆器中制备肺组织匀浆。（1）从肺组织细胞中提取总RNA。（2）cDNA第1链的合成：70℃孵育5μl总RNA 10min，轻轻摇荡后迅速置于冰上;然后准备AMV逆转录酶0.6μL，Olig（dT）1μL，25mmol MgCl24μL,10×Buffer 2μL,10mmol dNTP 2μL,RNA酶抑制剂 0.5μL，总RNA 5μL,DEPC-H2O加至20L混匀。42℃孵育60min;95℃加热5min，然后冰浴5min，于-20℃保存。（3）TGF-β1片段及β-actin的扩增：准备模板cDNA 1μL，上游引物 （10μmol/L）1μL，下游引物 （10μmol/L）1μL，10×PCR buffer 2.5μL， dNTP（2.0mmol/L） 2.5μL，Taq 酶（5.0U/μL）0.2μL，ddH2O 16.8μL，总体积 25μL,94℃预变性5min，94℃变性 40s，50℃ （β -actin 51℃） 退火 40s，72℃延伸40s，共35个循环;72℃延伸10min，4℃保存。（4）1%琼脂糖凝胶行PCR产物的电泳分析：取出凝胶，在紫外观察灯下观察结果并拍片。拍照后应用捷达凝胶成像系统进行面积灰度扫描,以条带光密度值代表其表达量,计算出目的基因的相对表达量，然后进行统计学分析。

1.4 统计学处理 应用SPSS 12.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析及LSD法。

2 结果

结果见图1、表1。模型组TGF-β1mRNA表达水平明显高于空白组 （P＜0.01）;参七虫草胶囊高剂量组TGF-β1mRNA表达水平明显低于参七虫草胶囊中剂量组和参七虫草胶囊低剂量组 （P＜0.01）;参七草胶囊中剂量组TGF-β1mRNA表达水平表达水平低于参七虫草胶囊低剂量组（P＜0.05）;参七虫草胶囊高、中剂量组和泼尼松组TGF-β1mRNA表达水平明显低于模型组 （P＜0.01）;参七虫草胶囊低剂量组TGF-β1mRNA表达水平低于模型组（P＜0.05）;泼尼松组TGF-β1mRNA表达水平明显低于参七虫草胶囊中、低剂量组（P＜0.01）。

图1 各组肺组织TGF-β1mRNA表达

表1 各组肺组织TGF-β1mRNA表达比较 （±s）

表1 各组肺组织TGF-β1mRNA表达比较 （±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01;与参七虫草高剂量组比较，△P＜0.01;与参七虫草中剂量组比较，▲P＜0.05;与泼尼松组比较，●P＜0.01

n组 别空白组模型组参七虫草胶囊高剂量组参七虫草胶囊中剂量组参七虫草胶囊低剂量组泼尼松组10 10 10 10 10 10 TGF-β1mRNA 139.04±9.95**193.96±6.61 160.19±9.20**178.34±5.17**△●185.88±7.79*△▲●155.19±8.78**

3 讨论

肺纤维化是由于过多的成纤维细胞（Fb）聚集和大量细胞外的基质成分沉积并伴炎症和损伤而导致正常的肺组织结构改变和功能丧失的一类疾病。多种因素均可引起肺纤维化,如职业性粉尘暴露（SiO2等）、放射性损伤、感染后、结节病等自身免疫性疾病、肺移植后、某些药物及原因不明的肺纤维化、特发性肺纤维化（IPF）等。目前,肺纤维化发生的确切机制还不十分清楚,尚未找到突破性的防治手段。TGF-β1在肺纤维化及其他纤维增殖性疾病中发挥了重要作用,被大多数学者公认为肺纤维化形成与发展的关键性细胞因子。研究发现TGF-β1基因具有多态性,而且这种多态性能影响其转录,并与多种因素引起的PF中TGF-β1水平特征性升高密切相关。TGF-β1主要作用于胶原的转录和翻译过程,能诱导前胶原mRNA产生,从而促进胶原蛋白的形成沉积。在肺的发育过程中,TGF-β1各亚型和TGF-β1mRNA主要分布于细支气管、支气管黏膜上皮、支气管腺体、支气管和脉管平滑肌和肺泡巨噬细胞中[5]。TGF-β1不仅能刺激成纤维细胞增殖及分泌胶原,还能抑制胶原的降解,在肺纤维化发展中起关键作用[6]。中医学多将肺纤维化归属于 “肺痹”、“肺痿”范畴，根据中医学理论，结合中医证候临床流行病学调查资料和本研究团体的长期临床实践，我们认为肺纤维化早期为肺虚，继而导致脾肾亏虚。但虚久必瘀，瘀致气阻，虚瘀气阻互结是肺纤维化发生的关键环节;即虚瘀贯穿于肺纤维化的全过程。本研究以益气养阴、活血化瘀、益肺固肾法则，采用参七虫草胶囊[7]，方中西洋参为君药，辅以冬虫夏草益肺肾之精，佐以参三七活血化瘀归肝胃经以治标。诸药合用，标本同治，补虚不留邪，祛邪不伤正，在临床应用过程中效果明显。本实验发现参七虫草胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组和泼尼松组均具有降低TGF-β1mRNA表达水平的作用，且参七虫草胶囊高、中剂量组降低TGF-β1mRNA表达水平优于参七虫草胶囊低剂量组。泼尼松组和参七虫草胶囊高剂量组相比对降低TGF-β1mRNA表达水平的作用无显著差异，而泼尼松组降低TGF-β1mRNA表达水平显著优于参七虫草胶囊中、低剂量组。本实验从基因水平观察了参七虫草胶囊对肺纤维化大鼠TGF-β1mRNA表达水平的作用，为参七虫草胶囊防治肺纤维化提供了理论基础，同时也为参七虫草胶囊结合泼尼松治疗肺纤维化从而减轻糖皮质激素的副作用提供了可行性依据。

[1]Venkatesan N,Roughley PJ,Ludwig MS.Proteoglycan expression in-Bleomycin lung fibroblasts:role of transforming growth factor-beta（1）and Interferon-gamma[J].Am J Physio lLung Cell Mol Physiol,2002,283（4）:806～814.

[2]齐曼古丽·吾守尔,夏宇,巴哈尔古丽·米吉提,等.博莱霉素致大鼠肺纤维化模型的建立方法及比较 [J].新疆医科大学学报,2005，28（6）:495 ～ 498.

[3]张念志，李泽庚,季红燕，等.参七虫草胶囊对慢性阻塞性肺疾病大鼠模型内皮素和一氧化氮水平的影响[J].中国实验方剂学杂志,2006，10（12）:39～40.

[4]孙瑞元.定量药理学[M].北京:人民卫生出版社,1987：243.

[5]Alberti A,Sarchielli P,Gallinella E,et al.Plasma cytokine levels in patients with obstructive sleep apnea syndrome：a Preliminary study[J].J Sleep Res,2003,12（4）:305～311.

[6]Chun Geun Lee,Soo Jung Cho,Min Jong Kang,et al.Early growth response gene 1-mediated apoptosis is essential for transforming growth factorβ1-induced pulmonary fibrosis[J].The Journal of Experimental Medicine,2000，（3）:377～389.

[7]张念志，干静云，张一萌，等.参七虫草胶囊对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺功能的影响[J].中国中医急症,2006,15（9）:1007～1008.

Effects of Shenqichongcao Capsule on the Expression of TGF-β1mRNA of Pulmonary Fibrosis Rats

ZHANG Nian-zhi1,XU Xiang-wen2,LI Guo-lin1,et al
1 The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine（Hefei 230031）2 Anhui University of Traditional Chinese Medicine（Hefei 230031）

Objective:To evaluate the Shenqichongcao Capsule on the expression of TGF-β1mRNA of pulmonary fibrosis rats.Methods:Rats,induced lung fibrosis by bleomycin,were isolated lung tissues and used RT-PCR and semi-quantitative image analysis method to analysis expression levels of TGF-β1mRNA of the normal control group,the model group,the Shenqichongcao Capsule high dose group,the medium dose group,the low dose group and the prednisone group.Results:The expression levels of TGF-β1mRNA in the lung tissue of the Shenqichongcao Capsule high dose group,the medium dose group,the low dose group and the prednisone group were significantly lower than that of the model group.Conclusion:The expression levels of TGF-β1mRNA in the lung tissues could be regulated in the Shenqichongcao Capsule high dose group,the medium dose group,the low dose group and the prednisone group.And then,the degree of lung fibrosis in rats of these groups could be reduced.

Shenqichongcao Capsule;Lung fibrosis;TGF-β1;RT-PCR

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0089-03

2009-08-06）