苦瓜蛋白诱导K562/A02细胞凋亡

尹丽慧，熊术道，叶爱芳，韩义香，章圣辉，吴建波

(温州医学院附属第一医院 内科实验室，浙江 温州 325000)

苦瓜蛋白是从苦瓜种籽中分离出来的一种碱性糖蛋白，属于I型植物核糖体失活蛋白（ribosomal inactivating protein，RIP），其 RNA N-糖苷酶活性能使真核细胞核糖体28S rRNA第4323位腺嘌呤糖苷键水解、断裂，从而无法与延长因子2结合并导致60S亚基失活，进而使蛋白质的合成受到不可逆的抑制。近年来，陆续有研究表明，I型RIP具有抗肿瘤作用，而其抗肿瘤作用依赖于其介导的细胞凋亡。我们以往的研究也表明，苦瓜蛋白具有良好的抗肿瘤作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡[1-2]。Pongnikom等[3]研究发现宫颈癌患者在化疗过程中同时服用苦瓜45～90 d，其P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）水平明显下降，而单纯化疗的患者P-gp表达没有改变，提示苦瓜中某种成分具有下调P-gp表达的作用。但目前有关苦瓜蛋白对耐药肿瘤细胞作用的研究国内外少有报道。本研究以多药耐药(multi-drug resistance，MDR)K562/A02细胞为模型，从细胞凋亡、P-gp表达及caspase活性等方面研究苦瓜蛋白对K562/A02的细胞生物学作用，探讨苦瓜蛋白对耐药肿瘤细胞作用的分子机制，以期为白血病多药耐药治疗寻找一种新的药物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料：多药耐药细胞株K562/A02购自中国医学科学院血液学研究所；苦瓜蛋白由本实验室提取[2]。

1.1.2 试剂：RPMI1640（美国GIBCO公司）；胎牛血清（天津市正江高科技有限公司）；100×青霉素-链霉素双抗液（美国GIBCO公司）；CCK-8（日本同仁化学研究所）；Annexin V kit（Bender Medsystems公司）；荧光标记单抗（BD公司）；caspase-8 kit（联科公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：K562/A02细胞用含10%FBS，100 U青霉素、链霉素的RPMI1640培养液，予37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，长满后按悬浮细胞常规传代法进行传代培养。

1.2.2 细胞毒性试验：取对数生长期K562/A02细胞，按1×105/mL接种96孔板，每孔加100μL，24 h后分别加入0、2、5、10、20、50和100μg/mL苦瓜蛋白，每组6复孔，继续培养48 h，加入CCK-8，37 ℃孵育1 h，酶标仪测OD值，计算细胞增殖抑制率，IC50。

1.2.3 AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡：取对数生长期细胞，按1×105/mL接种于24孔板，24 h后分别加入0、5、10和15μg/mL苦瓜蛋白，作用48 h后，每个标本收集2×105个细胞，按试剂盒说明书进行操作，用FACS Calibur型流式细胞仪检测。

1.2.4 细胞凋亡细胞形态学的检测（姬姆氏染色）：取对数生长期细胞，按1×105/mL接种于6孔培养板，分别予0、5、10和15μg/mL苦瓜蛋白，药物作用48 h后，收集细胞，制成细胞涂片，姬姆氏染色10 min，镜下观察，拍照。

1.2.5 苦瓜蛋白对P-gp表达和caspase-3活性的影响：取对数生长期细胞，按1×105/mL接种于24孔板，分为对照组和苦瓜蛋白组，药物作用48 h后，每个样本收集细胞（2～3）×105个细胞，按试剂盒说明书进行操作，用FACS Calibur型流式细胞仪检测。

1.2.6 苦瓜蛋白对caspase-8活性的影响：取对数生长期细胞，按1×105/mL接种于24孔板，阴性对照组加入Z-VAD-FMK 1μL/mL，对照组和苦瓜蛋白组分别加入0、5、10和15μg/mL苦瓜蛋白，每个标本收集3×105个细胞，按试剂盒说明操作，上机检测。

1.3 统计学处理方法 样本均数比较采用软件进行单因素方差分析；IC50采用加权线性回归方法计算。

2 结果

2.1 苦瓜蛋白对K562/A02细胞毒性试验 2μg/mL以上的苦瓜蛋白即能够显著抑制K562/A02细胞生长（P<0.05），抑制作用随着药物剂量的增加而增强，呈明显的剂量依赖关系（见图1）；48 h的IC50为（20.9±0.7）μg/mL。

图1 苦瓜蛋白抑制K562/A02增殖的作用

2.2 苦瓜蛋白诱导K562/A02细胞凋亡 0、5、10和15μg/mL苦瓜蛋白处理K562/A02细胞48 h，细胞凋亡率分别为（1.64±0.27）%、（4.02±0.51）%、(8.11±1.00)%和(16.36±1.47)%，(n=3)，苦瓜蛋白处理组与对照组相比较，差异有显著性(P<0.05)，其中，以15μg/mL组细胞凋亡最明显（见图2）。细胞涂片姬姆氏染色，光镜下观察发现用药组细胞核染色质浓集、聚集在核膜下呈半月形或指环状，核固缩、碎裂，凋亡小体等典型的凋亡细胞形态学改变（见图3）。

图2 ①对照组;②15μg/mL苦瓜蛋白处理48 h组，凋亡细胞明显增多Anexin V/PI双染法检测细胞凋亡（右下象限为Anexinn V阳性，PI阴性的凋亡细胞）

图3 K562/AO2经苦瓜蛋白处理前后的细胞形态学改变

2.3 苦瓜蛋白对P-gp表达的影响 流式细胞法检测显示，K562/A02细胞表面 P-gp蛋白呈高表达，表达率为（94.88±3.37）%(见图4①)，苦瓜蛋白处理K562/A02细胞48 h后，P-gp表达下调(见表1)，以15μg/mL苦瓜蛋白组最为明显(见图4②)，表达率下降了30.17%。

图4 苦瓜蛋白对K562/A02细胞P-gp表达及caspase活性的影响

2.4 苦瓜蛋白对caspase-3和caspase-8活性的影响 耐药细胞K562/A02的caspase-3和Caspase-8活性很低，分别为(6.52±2.03)%和(9.82±1.08)%(见图4③⑤)，经苦瓜蛋白处理后，caspase-3和caspase-8的活性显著增强（见表1），15μg/mL苦瓜蛋白组活化caspase-3和活化的caspase-8分别增至(81.91±8.87)%(见图4④)和(26.94±2.90)%(见图4⑥)。

表1 苦瓜蛋白对P-gp表达和caspase活性的影响（±s，n=3）

表1 苦瓜蛋白对P-gp表达和caspase活性的影响（±s，n=3）

与对照组比：*P<0.05,**P<0.01

组别(μg/mL)051 0 15 F值P-gp 94.88±3.37 87.54±2.31*81.43±3.81*74.71±4.51**14.39 caspase-3 6.52±2.03 21.79±4.34*55.52±5.96**81.91±8.87**50.15 caspase-8 9.82±1.08 14.85±1.70*17.67±1.91*26.94±2.90**19.23

3 讨论

白血病细胞对化疗药物产生MDR是临床上白血病患者化疗失败和复发的主要原因，克服白血病多药耐药，已经成为白血病治疗的重要课题。白血病MDR的发生均伴随着细胞凋亡受抑的现象，绝大多数常规化疗药物几乎不能诱导耐药细胞凋亡。苦瓜蛋白是从苦瓜中分离出来的一种植物糖苷酶，能够使核糖体失活，抑制细胞蛋白质合成。苦瓜蛋白能显著抑制白血病敏感细胞株K562细胞增殖，诱导K562细胞凋亡[2]，但有关苦瓜蛋白对MDR细胞的研究国内鲜见有报道。K562/A02细胞是以P-gp蛋白升高为主要耐药机制的细胞株，它对长春新碱、阿霉素、柔红霉素等有不同程度的耐药现象[4]，为本研究理想的实验模型。本研究表明2μg/mL以上苦瓜蛋白能显著抑制耐药白血病细胞K562/A02的增殖活性，呈明显的剂量-效应依赖关系，苦瓜蛋白处理K562/A02细胞48 h的IC50为（20.9±0.7）μg/mL。AnnexinV/PI双染显示苦瓜蛋白处理后凋亡细胞显著增加，以15μg/mL组细胞凋亡最明显，形态学研究显示用药组细胞呈现典型的凋亡细胞形态学改变。以上提示苦瓜蛋白对常规化疗药物耐药的K562/A02细胞保持敏感性，并能促使耐药细胞凋亡。

白血病化学治疗中药物诱发的MDR常见、主要的机制是耐药蛋白P-gp过度表达和细胞凋亡受抑制，对绝大多数常规药物不敏感[5-7]。近年来的研究表明P-gp除通过从细胞内逆浓度梯度排出抗肿瘤药物，降低细胞内药物浓度，使药物无法对白血病细胞构成有效杀死而引起耐药；还通过抑制caspase的激活来调节由多种因素诱发的细胞凋亡，特别是依赖caspase的激活凋亡途径[8-9]。我们的研究也证实了P-gp蛋白在K562/A02细胞中呈高表达状态，且同时存在caspase-3和caspase-8活性受抑制，提示P-gp可能通过抑制caspase的凋亡通道参与K562/A02细胞多药耐药性和凋亡抑制的形成。我们的研究表明，苦瓜蛋白诱导K562/A02细胞凋亡的过程中，存在着P-gp蛋白表达下调现象，15μg/mL苦瓜蛋白处理后P-gp蛋白表达率下降了30.17%；而caspase-3和caspase-8活性显著增强，15μg/mL苦瓜蛋白处理后分别升高了75.39%和17.12%，因此我们认为苦瓜蛋白能抑制P-gp表达，解除P-gp对caspase-3和caspase-8的抑制，从而逆转因P-gp高表达对caspase的凋亡通道的抑制效应而促进耐药细胞凋亡，是苦瓜蛋白诱导耐药白血病细胞凋亡的关键机制。

[1] 叶爱芳,尹丽慧,熊术道,等.苦瓜蛋白对H22细胞增殖抑制作用的实验研究[J].温州医学院学报,2008,38(4):328-332.

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