白色念珠菌临床株基因分型及耐药性研究

卓佳，陈柏坤，黄慧燕，徐瑜，张洪勤

(温州医学院，浙江 温州 325035，1.生物学实验教学中心；2.附属第二医院)

白色念珠菌广泛分布于自然界，也是人体的一种条件致病菌，正常人体的皮肤、口腔、肠道、肛门、阴道等处均可分离出该菌。近年来，随着免疫抑制剂、介入性检查治疗手段的广泛应用，肿瘤化疗、放疗，器官移植，艾滋病和社会老龄化等因素引起的免疫功能低下人群比例增高，临床真菌感染呈上升趋势，尤其是近年来抗真菌感染的治疗或者预防性治疗，导致真菌感染菌株及耐药趋势发生变化[1]。本研究采用PCR分型方法，对临床分离的121株白色念珠菌进行基因分型，并对不同基因型白色念珠菌进行药物敏感性研究。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 2006年7月至2008年3月间温州医学院附属第二医院临床分离的121株白色念珠菌。标本来源于痰、咽拭子、生殖道分泌物、尿液、血液、粪便、腹水、伤口分泌物等。质控菌株为白色念珠菌ATCC60193，购自卫生部临床检验中心。

1.2 仪器和试剂 法国科玛嘉显色培养基（CHRO Magar Candida）、API 20C AUX系统购自法国生物梅里埃公司；沙保弱琼脂培养基、玉米-吐温80培养基、含2%葡萄糖和0.5μg/mL美兰的M-H琼脂培养基、YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL，pH6.0（自制）；2%蜗牛酶；原生质缓冲液：1 mol/L山梨醇，0.02 mol/L柠檬酸，0.02 mol/L磷酸氢二钠，pH5.8；SE缓冲液：1 mol/L山梨醇，0.0625 mol/L EDTA，pH 8.0；丹麦ROSCO Neo-Sensitab抗真菌药敏纸片：制霉菌素（NYS）50μg/片，氟康唑（FL）25μg/片、酮康唑（KET）15μg/片，咪康唑（MTC）10μg/片，两性霉素B（AMB）10μg/片，伊曲康唑（IT）8μg/片，由杭州康裕贸易有限公司提供；PCR使用试剂，包括Taq聚合酶以及引物的合成，由上海生工生物工程技术服务有限公司产品；梯度PCR仪（Eppendorf公司）；Bio-RAD凝胶成像及分析系统（gel-Doc2000美国）。

1.3 菌株的分离鉴定 标本按常规方法分离培养，对临床怀疑真菌感染的标本接种沙保弱培养基，将分离到的酵母样真菌接种于科玛嘉显色培养基，37 ℃孵育48 h，根据生长菌落的颜色作出鉴定，绿色菌落是白色念珠菌，紫色菌落是近平滑念珠菌，蓝色菌落是热带念珠菌。

1.4 白色念珠菌DNA的提取 取沙保弱平板纯培养的单个菌落接种于YEPD培养基中，35 ℃震荡培养过夜。2000 r/min离心10 min，弃上清液。三蒸水洗2次。菌体加600μL 2%蜗牛酶溶于原生质缓冲液，30 ℃水浴2 h。3000 r/min离心10 min，弃上清液。SE缓冲液 400μL悬浮细胞。3000 r/min离心10 min，弃上清液。沉淀加入450μL TE缓冲液，10% SDS 50μL，65 ℃水浴30 min。加200μL 5 mol/L乙酸钾，冰浴1 h。12000 r/min离心5 min，取上清液，加等体积无水异丙醇，混匀，-20 ℃静置20 min。12000 r/min离心20 min，弃上清液。加70%无水乙醇500μL，混匀，12000 r/min离心5 min，弃上清液，自然干燥，溶解于50μL TE缓冲液，-20 ℃保存。

1.5 白色念珠菌基因分型 采用特异引物扩增白色念珠菌基因组DNA的25SrDNA基因的内含子区，以内含子大小及其中可转座I型内含子片段的缺失或插入作为分型依据[2]。一对分型引物P1、P2分别位于可转座内含子的两翼。

P1：5’-ATA AGG GAA GTC GGC AAA ATA GAT CCG TAA-3’（up），30 mer，

P2：5’-CCT TGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTA GAT-3’(down)，30 mer；

PCR反应总体积30μL，含TaqDNA聚合酶0.2μL（1 U），dNTP1.5μL，引物P1、P2各1μL。扩增程序：预变性94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.6 药敏试验 吸取一定量的0.5McFland菌悬液用生理盐水1:1稀释。以无菌棉拭子蘸取稀释后的菌悬液从3个方向分别均匀接种于含2%葡萄糖和0.5μg/mL美兰的M-H琼脂培养基上，室温静置5～15 min，用无菌镊子将药敏纸片贴于琼脂表面。室温置15 min后转入35 ℃恒温培养箱培养18～24 h（未见生长者应培养24～48 h），判定标准按美国临床实验室标准委员会（NCCLS）酵母菌纸片扩散法敏感试验2003年方案[3]，按要求测量抑菌环直径，读取药敏结果。

1.7 统计学处理方法 率的比较采用x2检验。

2 结果

2.1 基因分型结果 以P1、P2为引物，以白色念珠菌DNA为模板进行PCR扩增，产物出现3种电泳图谱，据此分为3型：A型为450 bp的单一条带，B型为840 bp的单一条带，C型出现450 bp和840 bp2条带。质控菌株白色念珠菌ATCC60193的电泳图谱与A型相同。121株白色念珠菌的分型结果为：A型83株，B型27株，C型11株。见图1。

2.2 不同基因型白色念珠菌的耐药性分析 3种基因型白色念珠菌对伊曲康唑、氟康唑、咪康唑的耐药率差异有显著性（P＜0.05）。B型白色念珠菌对氟康唑、咪康唑的的耐药率明显高于A型菌株(分别为x2=4.682，P=0.030；x2=3.912，P=0.048)。C型伊曲康唑的耐药率明显高于A型菌株（x2=4.220，P=0.040）。具体见表1。

表1 A、B、C型白色念珠菌耐药性分析

3 讨论

随着白色念珠菌临床病例不断增加，分子分型技术已成为研究念珠菌病流行病学及合理选择药物的基础。rDNA广泛存在于各种生物体内，在进化过程中具有相同的起源和功能，可以反映物种间的进化关系，已被广泛应用于多种生物的鉴定、分型及物种进化分析。据证实[2，4]，白色念珠菌在25SrDNA编码区内存在一可转座I型内含子，内含子中至少存在三个插入片段：252、341、379 bp。形成可转座I型内含子的大小可有三种：379 bp（插入379 bp）、621 bp（插入379 bp和252 bp）、962 bp（插入379 bp、252 bp和341 bp）。5种型别中，A型（450 bp）无内含子，B型（840 bp）为379 bp内含子，D型（1080 bp）为621 bp内含子，E型（1400 bp）为962 bp内含子。379 bp内含子对基因中核糖体串联区的不对称插入形成C型（450和840 bp），也有学者认为C型可能是A型和B型通过有性繁殖方式产生的，或是两组的过渡型，但是目前还没有定论。

本实验中121株临床分离的白色念珠菌经PCR分为三型：A型67株，B型43株，C型11株。未发现D型（1080 bp）和E型（1400 bp）。A型为主要基因型，A型比例远远大于其他两型，与国内亓庆国等[5]研究相一致；而Chen等[6]对台湾分离的65株白色念珠菌分析表明A、B型比例相当，表明不同地区或不同研究对象白色念珠菌基因型的分布是不同的。

121株白色念珠菌的基因分型和真菌药敏实验结合分析，发现3种基因型白色念珠菌对伊曲康唑、氟康唑、咪康唑的耐药率差异有显著性（P＜0.05），对其他抗真菌药物的耐药率差异无显著性。B型和C型白色念珠菌对唑类药物的耐药率明显高于A型菌株。由此推论白色念珠菌特定基因型可能对某种抗真菌药物易产生耐药性，至于其耐药机制是否与I型内含子有关，目前还没有相关报道，有待于进一步研究。

临床实验室应积极开展真菌耐药性监测，为临床提供用药依据，指导临床合理使用抗真菌药物，以达到有针对性的治疗目标，预防和控制耐药菌株的产生和增加。恰当的基因分型可为研究白色念珠菌临床耐药的分子机制及流行病学调查提供基础，对控制真菌感染具有重大意义。

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[4] Tamura M, Watanabe K, Mikami Y, et al. Molecular characterization of new clinical isolates of Candida albicans and C.dubliniensis in Japan: analysis reveals a new genotype of C.albicans with group I intron [J]. J Clin M icrobiol, 2001,39(12):4309.

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[6] Chen KW, Chen YC,LOHJ, et al. Multilocus sequence typing for analyses of clonality of Candida albicans strains in Taiwan [J]. J Clin Microbiol, 2006,44(6):2172-2178.