四种重要致病性分枝杆菌DHPLC检测鉴别方法的建立*

陈 茹,毕英佐,刘志玲,刘志辉,马静云,曾碧健,吴晓薇,周 科,林志雄

2.华南农业大学;

3.广州市胸科医院;

四种重要致病性分枝杆菌DHPLC检测鉴别方法的建立*

陈 茹1,毕英佐2,刘志玲2,刘志辉3,马静云2,曾碧健1,吴晓薇1,周 科1,林志雄1

目的运用多重核酸扩增(PCR)联合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)分析技术原理,针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及副结核分枝杆菌建立多重PCR-DHPLC快速检测方法,实现同时检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌。方法根据四种分枝杆菌特异基因序列分别设计菌种特异核酸扩增引物,通过筛选优化试验建立四重核酸扩增体系,对核酸扩增产物采用DHPLC设备进行检测分析,每一菌种的核酸扩增产物分别形成DHPLC特征峰图。对结核分枝杆菌等51株分枝杆菌标准株和分离株样品以及沙门氏菌等22株常见微生物样品进行特异性检测试验;对四种分枝杆菌特异的核酸扩增产物分别制备克隆质粒,通过对梯度稀释的阳性质粒的检测试验,进行多重PCR-DHPLC灵敏度测试;对疑似病人痰液样品和疑似发病牛的组织样品进行检测,并与细菌分离培养法进行比较以验证临床检测效果。结果该方法能快速检测鉴别上述四种分枝杆菌,检测灵敏度达到102～103基因拷贝,从131份疑似病人临床样品中检出91份结核分枝杆菌阳性,从40份来自疑似发病牛群的临床样品中检出31份牛分枝杆菌阳性,检出率均高于细菌分离培养法。结论研究表明所建立的多重PCR-DHPLC方法能快速检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌,为人畜结核、副结核病诊断提供一种新型分子生物学技术手段。

变性高效液相色谱;结核分枝杆菌;牛分枝杆菌;禽分枝杆菌;副结核分枝杆菌;多重PCR

2.华南农业大学;

3.广州市胸科医院;

Email:chenr@iqtc.cn;ychenru@sina.com

分枝杆菌在自然界广泛存在,迄今已发现的有上百种,多数菌种对人畜有致病性〔1〕。其中,结核分枝杆菌(M.tuberculosis)与牛分枝杆菌(M.bovis)主要感染人与哺乳动物引起结核病;禽分枝杆菌(M.avium)感染禽类引起禽结核,也可感染人与家畜引起非典型肺炎;副结核分枝杆菌(M.paratubercu-losis)在分类上属禽分枝杆菌复合群,主要感染牛、羊等反刍动物引起副结核病。结核病危害严重,已成为全球主要公共卫生问题。结核病、副结核病均为国际动物贸易重点监控疫病,我国动物进出境检疫工作规定对这两种疫病实施严格的检疫。结核、副结核病的诊断主要涉及上述四种重要致病性分枝杆菌的检测鉴别。

分枝杆菌具有形态与结构相似,抗原交叉严重,常规诊断方法不易区分的特点,且各种分枝杆菌可在人畜禽间感染传播。准确检测鉴别不同致病性分枝杆菌可帮助查清结核病、副结核病传染源和传播途径,避免由于常规诊断方法特异性不理想造成错误扑杀动物等不必要的经济损失。另一方面,禽分枝杆菌等非结核分枝杆菌感染人引起的临床症状和病理变化与结核分枝杆菌的感染相似,而由于对抗结核药物不敏感,对大多数非结核分枝杆菌需采取不同的治疗手段〔1〕。因此,针对重要致病性分枝杆菌建立菌种特异的检测鉴定方法具有重要的流行病学意义和临床诊疗意义。

变性高效液相色谱(Denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术是一种利用离子对反相液相色谱技术原理进行核酸片段的分离和分析的新型核酸分析技术,可应用于进行微生物检测鉴别,具有高通量和自动化,准确性好,成本低等优势,国内外已见报道用于进行大肠杆菌等食品微生物的检测鉴别〔2-4〕、致病微生物耐药菌株的鉴别筛选以及遗传疾病的基因诊断〔5-7〕等。DHPLC技术根据核酸检测分析要求,可采用非变性、部分变性和完全变性几种不同的分析模式,基于核酸扩增片段差异的微生物鉴别检测技术采用非变性分析模式。本文采用多重核酸扩增与非变性DHPLC分析相结合的技术原理,首次建立了同时快速检测鉴别结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌和副结核分枝杆菌的四重PCR-DHPLC高通量检测分析方法,详见如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 副结核分枝杆菌标准菌株购自中国兽医与药品监督所(CVCC),其余分枝杆菌标准菌株均源自美国ATCC菌种保藏中心,卡介苗干粉(BCG)为兰州生物制品研究所产品(冻干皮内注射用卡介苗,批号20000912,含 106菌细胞/mg以上);结核分枝杆菌分离株样品由广州市胸科医院分离保存,牛分枝杆菌分离株样品由华中农业大学保存,禽分枝杆菌分离株样品、副结核分枝杆菌分离株样品由吉林农业大学保存。其它各种微生物标准菌株样品均购自中国医学微生物菌种保藏中心(CMCC)或美国ATCC菌种保藏中心,分离株样品由汕头出入境检验检疫局技术中心提供。详见表1。

1.1.2 主要试剂 PCR扩增用酶,采用TOYOBO公司KOD-PLUS DNA polymerase。三乙胺乙酰盐(T EAA,色谱纯)购自T ransgenomic公司,乙睛(色谱纯)购自TEDIA公司。

1.1.3 主要仪器 变性高效液相色谱仪(Transgenomic Wave 4500),核酸扩增仪(PE2700)。

1.2 目标基因选择与引物设计 参考文献报导,选取各菌种特异序列,采用专业软件设计对应扩增引物。结核分枝杆菌引物设计以该菌种基因组中一段特异的12.7kb插入序列(GenBank Accession No.:CP000717)为模板,扩增产物 213 bp,对应模板1702125bp～1702337bp位点(5'～3')序列;牛分枝杆菌引物设计以该菌种特异的一段229bp序列(GenBank Accession No.:AM408590)为模板,扩增产物241bp,对应模板1721081bp～1721321bp位点序列;副结核分枝杆菌引物设计以IS900插入序列(GenBank Accession No.:AY660657)为模板,扩增产物302bp,对应模板61bp～361bp位点序列;禽分枝杆菌引物设计以IS1245插入序列(GenBank Accession No.:L33879)为模板,扩增产物265bp,对应模板88bp～352bp位点序列。

1.3 分枝杆菌基因组DNA提取 从菌液、痰液、血液中提取分枝杆菌核酸的方法按文献〔8〕进行。从淋巴结、肺等临床样品中提取分枝杆菌核酸按以下方法操作:取适量淋巴结等组织(剔除脂肪、筋膜),按1∶2(W/V)加柠檬酸钠-磷酸缓冲液,充分研磨成乳剂,加等量4%NaOH溶液继续研磨使组织液化,75℃温浴0.5～1 h,取悬浮液(避免吸取粗渣),高速离心取沉淀,加灭菌0.01 mol/L pH 7.6 PBS 1mL洗 2次,取沉淀,加入 50 μ L DNA 提取液,56℃温浴30 min,98℃～100℃温浴10 min,加入等体积氯仿,振荡混匀后,离心取上清直接用于扩增反应。

1.4 阳性克隆质粒 通过PCR扩增各菌种特异基因片段(含1.2对应PCR产物),按常规基因克隆操作把PCR产物分别克隆到pMD19-T载体,构建的克隆质粒pMD19-M T,pMD19-MB,pMD19-PB9,pMD19-MA12质粒分别含结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、副结核分枝杆菌、禽分枝杆菌特异扩增序列,可作为本研究DHPLC检测阳性对照模板及敏感性试验模板。

表1 试验菌种与编号列表Table 1 List of tested bacterial strains

1.5 多重PCR体系和扩增条件 通过对引物用量、扩增循环条件等因素的比对优化试验,确定最佳反应体系如下:采用50μ L反应体系,反应液中含dNTP 0.2 mmol/L,八条引物每条各 0.2 μ mmol/L,Mg2+1.0 mmol/L,1 unit Taq酶;扩增循环条件为:94℃2min;94℃15s,62℃5s,68℃5s,35个循环;72℃,1min。

1.6 DHPLC分析条件 在非变性分析模式下,采用双链DNA多片段(double-stranded multiple fragment)分析模式,清洗模式采用active,样品进样量设为5μ L。分析检测过程仪器梯度参数由Navigator software分析软件控制设定。

1.7 临床样品的细菌分离培养 采用改良罗氏培养法,其中人临床样品的细菌分离培养鉴定试验由广州市胸科医院按医院标准规程完成;动物临床样品的细菌分离培养鉴定试验由华中农业大学按标准方法(GB/T 18645-2002)完成。

1.8 特异性试验 采用1.6的四重PCR反应体系和扩增条件,对表1中各菌种基因组DNA进行PCR扩增,按1.6进行扩增产物的DHPLC检测分析,对所建立的四重PCR-DHPLC体系进行特异性试验。

1.9 敏感性试验 按1.4制备各菌种对应的阳性模板克隆质粒,对四种质粒进行提取纯化后,测OD260吸光度值并换算成浓度值,根据公式:质粒拷贝数/μ l={总含量(μ g/μ l)}/{质粒分子碱基数 ×10-15μ g},换算成质粒单位体积对应的基因拷贝数,然后将每种质粒DNA分别进行10倍系列稀释,取每一稀释度质粒DNA样品进行四重PCR-DHPLC分析,每个稀释度均做2次以上重复试验,根据检测终点稀释度推算检测终点对应的基因拷贝数。

1.10 临床检测试验 取临床采集的人痰液样品、牛(淋巴结、牛肺)组织样品,分别进行细菌分离培养和四重PCR-DHPLC检测分析,并对2种方法的检测结果进行比较。

2 结 果

2.1 四重PCR-DHPLC特异性试验结果 按1.5、1.6对表1所列的50株分支杆菌菌株样品和沙门氏菌等24株其它微生物样品进行四重PCR扩增和DHPLC分析。结果显示,四重PCR-DHPLC能同时准确检测鉴别结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、副结核分枝杆菌与禽分枝杆菌,对这四种目标菌种的标准株和分离株样品的检测分析结果均出现相符的DHPLC特征峰图,而同时检测其它分枝杆菌以及各种常见微生物样品均无非特异性反应,在DHPLC分析图谱中未出现与上述四种目标菌种一致的特征峰图。图1显示上述四种分枝杆菌标准菌株单重模板以及四重模板(即将四种分枝杆菌DNA样品等量混合后作为四重扩增的模板)扩增产物的DHPLC分析标准特征图谱,图中还显示部分阴性菌株样品的检测图谱。图2分别显示四种分枝杆菌的标准株与分离株样品的检测分析结果,结果表明每一菌种的标准株与分离株样品均呈现稳定的DHPLC特征图谱。

图1 分枝杆菌的DHPLC特征图谱1:四重菌种模板检测图谱;2:结核分枝杆菌;3:牛分枝杆菌;4:禽分枝杆菌;5:副结核分枝杆菌;6:部分阴性菌种检测图谱.Fig.1 DHPLC standard chart of Mycobacteria strains1.Quadruplex templates;2.M.tuberculosis;3.M.bovis;4.M.avium;5.M.paratuberculosis;6.Negative strains.

2.2 四重PCR-DHPLC敏感性试验 按1.9进行敏感性试验与数据处理,以1.4所列四种阳性克隆质粒DNA系列稀释的样品为模板,进行四重PCR扩增和DHPLC分析检测。结果显示,四重 PCRDHPLC对结核分枝杆菌,牛分枝杆菌,副结核分枝杆菌,禽分枝杆菌阳性模板克隆质粒的检测敏感性可达 10-8到10-9稀释度,相当于约102～103个基因拷贝。

2.3 临床样品检测试验结果 从医院肺炎门诊采集疑似病人痰样131份,从呈现疑似临床症状的牛群中采集牛肺、牛淋巴结、牛血液等临床样品40头份,采用四重PCR-DHPLC方法和细菌分离培养方法分别进行检测试验。检测结果,采用两种方法均从人痰样中检出结核分枝杆菌阳性样品(未检出其它3种分支杆菌),四重PCR-DHPLC方法的检出率为69.5%(91/131),细菌分离培养法的检出率为63.3%(83/131);采用两种方法均从牛临床样品中检出牛分枝杆菌阳性(未检出其它3种分枝杆菌),四重PCR-DHPLC方法和细菌分离培养法检出率分别为77.5%(31/40)、62.5%(25/40)。对171份临床样品的检测试验表明,四重PCR-DHPLC方法对人与动物临床样品的检出率均高于细菌分离培养方法,其中,细菌分离培养呈阳性的样品均呈PCRDHPLC阳性。详见表2。

图2 四种分枝杆菌的标准株与分离株DHPLC检测分析结果Fig.2 DHPLC analysis of different strains of four species of Mycobacterium.

3 讨 论

传统的分枝杆菌检测鉴定方法包括镜检法和细菌分离培养法。镜检法敏感性低,不能进行菌种鉴定,而培养法耗时长。由于分枝杆菌生长缓慢,细菌分离培养常需数周时间,培养后还需进行各种繁琐的生化反应才能鉴定菌种,同时必须是“活菌”才能培养成功,因此传统的细菌学检查鉴定方法有其局限性,不利于疫情疫病快速确诊和临床治疗,也不能适应人员或动物进出境检验检疫快速通关要求。

表2 四重PCR-DHPLC与细菌分离培养对临床样品的检测结果比对Table 2 Comparison of quadruple PCR-DHPLC and culture method for detection of clinical samples

近年来,以PCR和实时荧光PCR为代表的分子生物学技术在结核或副结核病原菌快速检测鉴定方面发展较快〔8-10〕,但均为针对结核分枝杆菌复合群或副结核分枝杆菌等单一菌种,其中以荧光PCR方法最为敏感,但成本较高。由于多重实时荧光PCR技术还不成熟,对于同时检测多种相近的病原菌需要建立多套荧光PCR方法,在实际应用方面成本高的问题更为突出。因此,在重要致病性分枝杆菌快速检测鉴定方面进行新方法、新技术手段的研究开发具有现实意义。结核与副结核病的诊断涉及到多种致病性分枝杆菌的检测鉴别,适合运用DHPLC等高通量检测技术手段。目前已报导的相关DHPLC技术研究主要用于进行结核分枝杆菌耐药菌株的筛选鉴别〔11-12〕,即对分离培养获得的纯菌株采用DHPLC变性分析模式寻找确认耐药基因突变位点。在不同种分枝杆菌鉴别方面,仅有国内1篇文献报导采用DHPLC异源双链突变检测分析方法(部分变性分析模式)鉴别结核分枝杆菌与牛分枝杆菌〔13〕,仅限于对 1～2株标准菌株进行检测试验。

国际上DHPLC技术的相关研究进展迅速,已成为核酸分析技术研究与应用的一个热点。采用DHPLC技术一次可自动分析数十甚至数百个样品,实现了对核酸分子的高通量自动化分析,其特征图谱可精确到几个碱基的差异,不仅避免了常规PCR电泳检测的繁琐和易造成污染等问题,准确性也显著提高,其试剂成本仅相当于常规PCR,在实际应用方面有优势。将DHPLC技术与核酸扩增技术相结合建立新型核酸分析手段,在微生物的快速检测鉴别等方面具有很大的开发应用潜力。本研究采用多重核酸扩增联合非变性DHPLC分析方法,对结核分枝杆菌等四种重要致病性分枝杆菌建立了PCR-DHPLC鉴别检测分析手段。与国内报导的单重PCR扩增联合DHPLC分析检测微生物的研究工作不同,本研究可通过一次反应同时检测鉴别四种目标菌种,当待检样品中仅含有一种菌种时,其DHPLC分析图谱仅出现一个特征峰型,当样品中同时含有多个目标菌种时,其DHPLC分析图谱将同时呈现多个吸收峰(如图1)。

建立特异稳定的多重核酸扩增体系是多重DHPLC分析方法重要的技术内容。由于四种致病性分枝杆菌的核酸同源性高,其中结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的基因组序列同源性高达99%〔14〕,而副结核分枝杆菌在分类上与禽分枝杆菌均属禽分枝杆菌复合群,针对这四种分枝杆菌设计多重扩增引物并建立多重扩增体系难度较大。本研究在文献检索的基础上,通过对多条基因序列的比对分析,筛选确定了每一种分枝杆菌的目标基因,并通过大量检测试验筛选出各菌种的特异引物并确定四重体系中的引物组合。在多重扩增体系反应条件方面,通过检测试验筛选了具有高保真和热启动功能的DNA聚合酶,并通过梯度试验确定了采用高退火温度的扩增循环反应条件,确保了扩增反应特异高效。

DHPLC分析结果表明,四种分枝杆菌菌种均呈现独特的DHPLC特征图谱(图1),每一菌种的标准株和分离株样品均呈现稳定的DHPLC峰图(图2),重现性好;对十几种分枝杆菌的检测结果显示,不同菌种之间没有出现交叉反应,表明所建立的PCR-DHPLC体系特异性好、稳定可靠。临床检测试验结果表明,多重PCR-DHPLC方法能快速检测鉴定人或动物感染的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌,检出率高于细菌分离培养方法,而检测周期小于1d,表明临床适用性好。

本研究通过对多种分枝杆菌标准菌株和分离株样品、常见微生物样品、阳性模板克隆质粒以及人与动物临床样品的检测试验,表明所建立的多重PCRDHPLC检测分析技术能同时检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌,达到特异灵敏、快速高效的目的,可用于临床快速检测结核、副结核致病菌感染,也可用于对培养细菌进行菌种快速鉴定,适合在进出境检验检疫、公共卫生和动物疫病诊断和防控、流行病学调查研究等领域推广应用。

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Establishment of the denaturing high-performance liquid chromatography combined with multiplex nucleic acid amplification method for rapid identification of four important pathogenic mycobacteria

CHEN Ru,BI Ying-zuo,LIU Zhi-ling,LIU Zhi-hui,MA Jing-yun,ZENG Bi-jian,WU Xiao-wei,ZHOU Ke,LIN Zhi-xiong

(Guangdong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou510635,China)

A new molecular method for simultaneously rapid detection and differentiation ofMycobacteriumtuberculosis,Mycobacterium bovis,Mycobacterium aviumandMycobacterium paratuberculosiswas established by using denaturing highperformance liquid chromatography(DHPLC)combined with multiplex nucleic acid amplification.These 4 important pathogenic mycobacteria were identified by separation of 4 specific PCR-amplified target fragments by DHPLC analysis.A total of 51Mycobacteriumstrains and 22 other bacterial species were tested to confirm the specificity of the multiplex PCR-DHPLC assay.The sensitivity of the assay was as low as 102-103gene copies.This method rapidly identify the positive clinical samples from human and bovine with higher detection ratio than traditional culture method and was able to identify simultaneously four pathogenicMycobacterium,which provided a new molecular tool for rapid detection of tuberculosis and paratuberculosis in human and animals.

denaturing high-performance liquid chromatography;Mycobacterium tuberculosis;Mycobacterium bovis;Mycobacterium avium;Mycobacterium paratuberculosis;multiplex PCR

R535

A

1002-2694(2010)01-0041-05

*国家质检总局科技项目(2006IK019)

1.广东出入境检验检疫局,广州 510623;

2009-08-17;

2009-11-22