布鲁氏菌的脂肪酸分型研究*

赵振祥,崔步云,李兰玉,赵鸿雁,朴冬日,郝素珍

2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京102206

布鲁氏菌的脂肪酸分型研究*

赵振祥1,崔步云2,李兰玉2,赵鸿雁2,朴冬日2,郝素珍1

目的探索脂肪酸分型方法对布鲁氏菌进行分型的可能性。方法选择90株布鲁氏菌经化学方法提取菌体脂肪酸后,用气相色谱分析,获得布鲁氏菌脂肪酸成分的数据资料。并利用SPSS11.5统计软件对获得的数据资料进行聚类分析。结果布鲁氏菌脂肪酸分型方法将90株布鲁氏菌分为5组:第1组为部分牛种菌;部分羊种菌;部分猪种菌;部分绵羊附睾种;部分变异牛种;部分变异羊种;沙林鼠种标准株。第 2组为猪种 1、2、3、5型标准株和疫苗株 S2;羊种疫苗株 M28和Rev.1;绵羊附睾种标准株。第3组为部分羊种;部分变异羊种菌;部分牛种 3型和6型;犬种;部分绵羊附睾种。第 4组为犬种菌标准株。第5组为部分羊1型;部分变异羊种;部分牛1型;部分猪1型和3型。结论依据布鲁氏菌菌体脂肪酸含量差异可以对布鲁氏菌进行分型;依据19∶0CYCLOω 8c,18∶1ω 7c,16∶0三种脂肪酸含量差异可以区分猪种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌;脂肪酸分型结果进一步提示犬种布鲁氏菌不只1个生物型;脂肪酸分型结果进一步证实牛3型和牛6型布鲁氏菌高度同源。

布鲁氏菌;气相色谱;脂肪酸;聚类分析;分型

2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京102206

布鲁氏菌是一种胞内寄生兼性厌氧的革兰阴性微小球杆菌,其传统分类鉴定方法是根据培养生物特性、氧化代谢和抗原特征、噬菌体裂解特点以及主要宿主等不同,将布鲁氏菌属分为6个种19个生物型。它是联合国粮农组织和世界卫生组织布病专家委员会于1986年公布的,已获得国际社会公认。并且经过多年的实践检验被证明是一种很好的分型方法,在布病的防治工作中发挥了积极而重要的作用。但是,在实际分型工作中已经遇到一些使用传统分型方法无法将其分型的菌株,不仅表明传统的布鲁氏菌分型方法尚存在一定的缺陷,更重要的是严重影响对布病疫区分类的判定,从而不能对此采取合理有效的预防控制措施。因此,需要进一步完善或者寻找新的分型方法以解决布鲁氏菌分型中遇到的问题。

1963年Able〔1〕率先将气相色谱应用于肠杆菌的菌体脂肪酸成分分析,创建了一个全新的细菌化学分类方法。随着分析仪器和分析软件的逐渐完善,细菌菌体脂肪酸成分分析已经成为微生物化学分类方法的重要组成部分。对金黄色葡萄球菌、洋葱伯克霍尔德菌、铜绿假单胞菌等的研究表明,菌体脂肪酸成分分析能给出可靠的分型结果,可用于追溯传染源等流行病学研究〔2〕。我国学者对分枝杆菌〔3〕、鼠疫耶尔森菌〔4〕、念珠菌〔5〕、霍乱弧菌〔6〕等进行了脂肪酸分型研究,其中对部分细菌的分型取得了满意结果。

1977 年和 1981 年 Tanaka〔7〕,Dees〔8〕等曾用气相色谱测定了部分布鲁氏菌脂肪酸的组成,认为脂肪酸分型技术对布鲁氏菌的分型有一定意义。本研究用气相色谱获得布鲁氏菌脂肪酸成分的数据资料,并利用SPSS11.5统计软件对获得的数据资料进行聚类分析,探索对我国分离到的布鲁氏菌分型的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 布鲁氏菌的19个标准株、7个疫苗株,及我国分离到的56个典型布鲁氏菌菌株和8个非典型布鲁氏菌菌株。

1.2 培养条件 菌株均接种于布鲁氏琼脂(brucella agar,美国BBL公司)平板培养基上,35℃培养48h。

1.3 菌体脂肪酸甲酯的提取 4mm接种环收获培养48h的菌体一环置于冷冻干燥管中,加1mL MIDI溶液1(45g NaOH溶于150 mL CH3OH及150 mL H2O),封口,沸水浴30min皂化;冷却后转移至8 mL螺口管中,加2 mL MIDI溶液2(190 mL浓盐酸,275 mL CH3OH溶于135 mL H2O),盖严震荡,80℃±1℃水浴10 min甲酯化,冰浴冷却;加 1.25 mL MIDI溶液3(200 mL正己烷,200 mL乙醚混匀)萃取脂肪酸甲酯;加3 mL MIDI溶液4(10.8 g NaOH溶于900 mL H2O)萃取。取2/3上层有机相盛至2 mL气相色谱样品瓶中备用。

1.4 气相色谱分析系统及色谱条件 脂肪酸甲酯分析使用HP6890气相色谱仪,配备自动进样器,气相色谱条件参照MIDI Sherlock推荐方法设置;Sherlock系统根据流出组分的等值碳链长度(ECL)值进行脂肪酸成分的定性,并通过百分归一化进行各组分的相对定量。

1.5 聚类图的绘制 用SPSS11.5软件系统分析所得各实验菌株脂肪酸组成,绘制实验菌株基于菌体脂肪酸成分的聚类图。本研究使用的聚类分析方法为层次聚类中的类间平均连锁法。

2 结 果

2.1 部分菌株脂肪酸的气相色谱检测结果 从图1和图2可以看出,82号菌株在保留时间为8.180 min,13.397 min,15.274 min时有3条较高的峰出现,分别代表脂肪酸15∶0ANTEISO,18∶1ω 7c,19∶0CYCLOω 8c,经计算含量分别为 13.95%,27.77%和 26.15%。75号菌株在保留时间为10.222 min,13.372 min时有两条较高的峰出现,分别代表脂肪酸 16∶0和 18∶1ω 7c,经计算含量为8.34%和85.18%。可以看出,依据峰的面积和位置的不同可以区别不同的菌株,即可以根据脂肪酸含量和种类的差异对布鲁氏菌鉴定和分型。

2.2 本研究90株布鲁氏菌的聚类结果 图3将90株布鲁氏菌分为5组:第1组为部分牛种菌;部分羊种菌;部分猪种菌;部分绵羊附睾种;部分变异牛种;部分变异羊种;沙林鼠种标准株。第2组为猪种1、2、3、5型标准株和疫苗株S2;羊种疫苗M28和Rev.1;绵羊附睾种标准株。第3组为部分羊种;部分变异羊种菌;部分牛种3型和6型;犬种;部分绵羊附睾种。第4组为犬种菌标准株。第5组为部分羊1型;部分变异羊种;部分牛1型;部分猪1型和3型。

图3 90株布鲁氏菌的聚类图Fig.3 Dendrogram of 90 experimental strains

3 讨 论

3.1 采用脂肪酸分型技术对90株布鲁氏菌分型的初议 采用脂肪酸分型技术对布鲁氏菌分型的结果显示我国分离到的64株布鲁氏菌被分到三个组,绝大多数被分入第1组,少数被归到第3组和第5组,第1组又可以分为牛种菌和羊种菌两个小组,但其中又有个别相互交错的现象。但没有菌株分离时间、地点、宿主的分布特征。从脂肪酸分型结果可以发现,它与传统分类方法分型结果存在一致性又有差异,这说明传统分类方法与菌株脂肪酸组成既有联系又有区别。Rep-PCR分型结果〔9〕和 PFGE分型结果〔10〕也与传统分类方法分型结果存在差异,但也与脂肪酸分型结果有差异,且这4种方法得到的结果两两互不相同。哪种分型方法更能反映布鲁氏菌的进化关系和分类地位,用于溯源工作,尚需进一步研究。但传统分类方法,脂肪酸分型、Rep-PCR分型和PFGE分型都从不同侧面反映了布鲁氏菌的细菌分类特点。由此可见,布鲁氏菌的脂肪酸分型方法有其特有的优势,可作为布鲁氏菌属细菌鉴定、分类的补充技术。

3.2 脂肪酸组成分析对某些种、型布鲁氏菌的分类探索

3.2.1 犬种布鲁氏菌的分类 国内分离到的犬种菌和犬种菌标准株 RM6/66的脂肪酸含量与种类差异较大,提示犬种菌可能不只1个生物型。Rep-PCR分型技术就将犬种布鲁氏菌分为3组,其中典型犬种菌分到两个不同组〔9〕。PFGE分型结果也显示犬种菌之间的相似度较差〔10〕。Vizcaino N.等采用PCR-RFLP方法对布鲁氏菌omp-31基因的研究中,犬种布鲁氏菌也被分为两组〔11〕。关于犬种布鲁氏菌的种型问题,根据细菌对硫堇和复红的耐受,1985年Corbel等〔12〕对世界上收集的 62株犬种布鲁氏菌鉴定表明,对两种染料的耐受分为4种,尚德秋〔13〕等对143株犬种布鲁氏菌的鉴定分为6种状态,综合分析,根据犬种布鲁氏菌对两种染料的状况可以分为两个型。64号菌株是我国于1987年从牛体分离到的犬种菌,而从牛体分离到犬种菌在国际上目前只有这1例,这株菌经传统分类方法鉴定为犬种菌〔14〕。脂肪酸分型结果印证了这株菌确是犬种菌。

3.2.2 猪种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌的脂肪酸组成差异 猪种布鲁氏菌依据脂肪酸含量差异分为3组,第一组以16∶0,19∶0CYCLOω 8c,18∶1ω 7c三种脂肪酸为主。第二组以15∶0ANTEISO,18∶1ω 7c,19∶0CYCLOω 8c为主。第三组以 15∶0ANTEISO,15∶0ISO,16∶0ISO为主。所有的犬种布鲁氏菌含19∶0CYCLOω 8c很低,一组以18∶1ω 7c为主,另一组以16∶0为主。因此,区分这两种布鲁氏菌时仅仅根据19∶0CYCLOω 8c来判定是不充分的,还应结合18∶1ω 7c,16∶0来判定,完善了Dees等〔8〕提出的观点。

3.2.3 牛种3型和牛种6型布鲁氏菌脂肪酸对比本研究中很多牛种3型和牛种6型布鲁氏菌脂肪酸含量非常相似,符合传统方法鉴定结果。因为牛种3型和牛种6型在生物学特性上十分相似,在它们之间仅有对硫堇敏感性的明显差别,在硫堇为40 μ g/mL时,牛种3型生长而牛种6型不生长。Tolari等〔15〕就曾提出牛种布鲁氏菌3和6生物型是一个生物型,建议分类为牛种布鲁氏菌3/6生物型。脂肪酸分型的研究进一步证实了牛种3型和牛种6型布鲁氏菌高度同源。

3.3 非典型布鲁氏菌菌株的归属 本研究选用了8株非典型布鲁氏菌菌株,应用脂肪酸分型方法可以在分类表中找到合适的位置,但仅限于种的水平,不能具体到型的水平上,可作为传统分类方法的补充。

本研究采用脂肪酸分型技术对90株布鲁氏菌进行分型鉴定研究,并与传统分类方法、Rep-PCR和PFGE分型技术进行对比、讨论与分析。我们认为,布鲁氏菌属细菌的脂肪酸组成可以从另一个侧面反映布鲁氏菌鉴定分类特点。这4种分类方法各不相同,各具特色,相互不能替代。需要对这几种鉴定结果综合分析,乃至采用其它分型方法进行分类、对比,方能对布鲁氏菌属细菌的进化关系予以进一步澄清。靠任何单一技术与方法都很难判定菌株历史进化地位。

(感谢军事医学科学院微生物流行病学研究所刘海洪博士和杨瑞馥教授及中国疾病预防控制中心传染病预防控制所尚德秋研究员和李元凯研究员的指导。)

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Typing on the cellular fatty acids ofBrucellaspecies by Gas-chromatography analysis

ZHAO Zhen-xiang,CUI Bu-yun,LI Lan-yu,ZHAO Hong-yan,PIAO Dong-ri,HAO Su-zhen

(Departmentof Microbiology and Immunology,Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China)

To investigate the the possibility to utilize the cellular fatty acid(CFA)information as a method inBrucellatyping,90Brucellastrains were subjected to the study on CFAs,and all the experimental strains were inoculated onBrucellaAgar plates for 48 hours.After that,cells were harvested,saponificated,methylated and extracted to provide fatty acids methylesters for gas chromatography analysis.Based on the CFAs data matrix,dendrogram of 90 experimental strains was generated by SPSS11.5 software package.As shown in the dendrogram,90Brucellastrains could be divided into 5 clusters.The first cluster included some species ofBrucellaabortus,Brucella melitensis,Brucella suis,Brucellaovis;and some of the variant strains ofBrucellaabortus andBrucellamelitensis and the typical strain ofBrucellaneotomae.The second cluster included typical strains ofBrucella suis(1,2,3 and 5 types);vaccine strains ofBrucella suisS2;vaccine strains ofBrucellamelitensisM28、Rev.1 and typical strain ofBrucella ovis.The third cluster included some ofBrucella melitensis;some of the variant strains ofBrucella melitensis;some ofBrucellaabortus(3,6 types);Brucella canisandBrucella ovis.The fourth cluster was the typical strain ofBrucella canis.and the fifth cluster included some ofBrucellamelitensis(1 type);some ofBrucellaabortus(1 type);some of the variant strains ofBrucella melitensisandBrucella suis(1,3 type).It is apparent that CFAs information can be used in brucella typing.andBrucellasuisandBrucella caniscan be distinguished by the difference in the CFA contents of 3 fatty acids 19∶0CYCLOω 8c,18∶1ω 7c and 16∶0.The results of CFAs typing inBrucellaspecies show thatBrucella canisincludes 2 biovars at least and the high homologization ofBrucella abortus(3 type)andBrucella abortus(6 type)can be found.

Brucella;gas-chromatography;fatty acids;cluster analysis;typing

R378.5

A

1002-2694(2010)01-0013-04

*国家“973”计划资助项目(F973_2002CB513206)

崔步云,Email:cuibuyun@icdc.cn

1.山西医科大学微生物学与免疫学教研室,太原030001;

2009-04-21;

2009-11-25