rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值*

王 敏,李文桂,蔡世飞,周必英

rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值*

王 敏,李文桂,蔡世飞,周必英

目的探讨rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值。方法利用纯化的rSj26-Sj32融合蛋白和日本血吸虫成虫抗原(SjAWA)建立HRP-IgG-Dot-ELISA检测急性日本血吸虫病患者血清,并以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、棘球蚴病、乙型肝炎、肺结核病患者和健康人血清作对照,观察二者的检测结果。结果rSj26-Sj32和SjAWA检测急性日本血吸虫病患者阳性检出率均为100%,特异性分别为95.35%和93.02%;二者均与华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和泡型棘球蚴病患者血清存在不同程度的交叉反应。结论纯化的rSj26-Sj32融合蛋白是一种较好的免疫诊断抗原。

日本血吸虫病;rSj26-Sj32融合蛋白;Dot-ELISA法;免疫诊断

日本血吸虫病是由日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)引起的一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,是国家卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。中国现症患者67.12万人,病牛2.48万头,钉螺面积38.01亿平方米,受威胁人口4 000万以上〔1〕。开发高度敏感和特异的标准化免疫诊断试剂是当前日本血吸虫病研究的重点内容。Sj26是一个较好的诊断抗原分子,王细宏等〔2〕发现重组Sj26能够识别抗Sj26的 IgG抗体,通过间接ELISA检测急性日本血吸虫病患者血清的敏感性为90.6%,并具有较高的特异性。石佑恩等〔3〕采用酶联免疫印渍实验发现Sj有31/32kDa(Sj31/32),并证明其具有较高的诊断价值。本研究利用rSj26-Sj32-H RP-IgG-Dot-ELISA检测急性日本血吸虫病患者血清,并与日本血吸虫成虫粗抗原(SjAWA)H RP-IgG-Dot-ELISA检测相比较,观察rSj26-Sj32融合蛋白用于诊断急性日本血吸虫病的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清标本 急性日本血吸虫病患者血清50份由武汉市卫生局王家刚老师惠赠;华支睾吸虫病患者血清21份、卫氏并殖吸虫病患者血清13份、泡型棘球蚴病患者血清10份、囊型棘球蚴病患者血清9份和肺结核病患者血清20份由本室保存。正常人血清43份和乙型肝炎患者血清20份由重庆医科大学附属第一医院罗亚老师惠赠。

1.1.2 试剂及仪器 BL21(pET28α-Sj26-Sj32)重组菌由本室保存,HRP标记的羊抗人IgG购自SouthernBiotech公司,Ni-NTA试剂盒购自QIAGEN公司,酶标仪购自Bio-tek公司,BioRad Gel Doc 1000凝胶成像仪购自Bio-Rad公司,硝酸纤维素膜购自重庆鼎今公司。

1.1.3 Dot-ELISA测定装置 参照丁建祖〔4〕的方法进行制作。塑料小盒为4cm×3cm×0.6cm的扁盒,分为底、盖两部分,盖中央有直径0.5cm的圆孔;盒内充满吸水垫料,市售圆筒纸手工折叠而成,盖孔下紧贴垫料;垫料上放置硝酸纤维素膜(NC膜)一片,硝酸纤维膜片为1.0cm×1.5cm长方形条块,在pH 为7.4的PBS中浸泡30min,待其自然干燥后装入测定装置。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒 pET28α-Sj26GST-Sj32在大肠埃希菌BL21(DE3)中的诱导表达 经鉴定含有重组质粒 pET28α-Sj26GST-Sj32的大肠埃希菌BL21(DE3)在含卡那霉素的 LB培养基中37℃250 r/min振摇培养至A值0.5～0.8时,取适量作为未诱导对照,其余加入终浓度为 1 mmol/L的IPTG 于37 ℃诱导表达,分别在诱导后1、3、5、7、9、11和13 h各收集1 mL菌液。

1.2.2 重组质粒 pET28α-Sj26GST-Sj32表达产物的SDS-PAGE分析 上述菌液10 000 r/min离心2min,分别收集菌体,以50μ L的 1×蛋白上样缓冲液重悬后煮沸5 min,取20μ L用5%的浓缩胶和10%的分离胶进行SDS-PAGE电泳,以考马斯亮蓝染色,脱色后经BioRad薄层凝胶扫描分析系统分析重组蛋白的表达情况。

1.2.3 rSj26-Sj32抗原纯化 将上述收集的细菌沉淀用 PBS重悬,超声粉碎后 5 000r/min离心10min,利用pET表达载体携带的聚组氨酸(Histag)标签,用Ni-NTA试剂盒纯化,按说明书操作,测定其蛋白浓度为0.21mg/mL,用双蒸水稀释至0.1μ g/μ L。分别取不同培养时间诱导表达的重组蛋白20μ L用5%的浓缩胶和10%的分离胶进行SDS-PAGE电泳,以考马斯亮蓝染色,脱色后经BioRad薄层凝胶扫描分析系统分析重组蛋白的表达情况。

1.2.4SjAWA制备 日本血吸虫成虫粗抗原(AWA),按报道方法制备〔5〕。从感染2 000条日本血吸虫尾蚴后43d的家兔体内收集成虫,低温干燥后加入适量PBS,冰浴下磨成匀浆,反复冻融,低温离心(10 000r/min)30min,取上清即为AWA,测定蛋白浓度为2.01mg/mL,用双蒸水稀释至1μ g/μ L。

1.2.5 rSj26-Sj32和SjAWA抗原包被浓度以及血清稀释度选择 在进行Dot-ELISA实验时,先进行 ELISA 实验 ,按 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0μ g/孔的rSj26-Sj32融合蛋白包板(抗原包被液200μ L/孔),按 0.2、0.4、0.6、0.8 、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 和 2.4μ g/孔SjAWA 包板;血清按1∶100、1∶200、1∶400和 1∶800稀释;1∶1 000羊抗人IgG的工作浓度;在常规操作下检测10份日本血吸虫病患者混合血清(阳参)和10份健康人混合血清(阴参),以阳参/阴参的A值之比最大、PBS对照本底最低时选择为最适条件。将10份日本血吸虫病患者混合血清和10份健康人混合血清分别以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400和 1∶800稀释度进行预实验,以阳性血清吸光度OD450值与正常对照血清OD450值的比值(S/N)最大时的稀释度为最佳稀释度。

1.2.6 rSj26-Sj32/SjAWA-HRP-IgG-Dot-ELISA

每孔NC膜中央点加 rSj26-Sj32融合蛋白 4μ L(0.1μ g/μ L)和 SjAWA 2μ L(1μ g/μ L),室温干燥;后加入封闭液200μ L,室温干燥;分别加1∶50待检稀释血清100μ L,37℃孵育1h;加入 1∶1 000稀释H RP-IgG 抗体 100μ L,37℃孵育 30min;加底物液50μ L,37℃孵育 20min;最后加 2mmol/L H2SO450μ L终止反应。5min内肉眼观察结果,若在NC膜上出现红色斑点为阳性,否则为阴性。

1.2.7 统计学分析 rSj26-Sj32和SjAWA Dot-ELISA检测的敏感性和特异性比较用卡方检验。

2 结 果

2.1 重组质粒 pET28α-Sj26GST-Sj32在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达产物SDS-PAGE分析重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,菌体蛋白的SDSPAGE结果显示其分子质量单位约为69 kDa,与预期值相符。薄层扫描分析显示Sj26GST-Sj32融合蛋白占菌体总蛋白的25%,且在IPTG诱导5 h～7 h蛋白表达量最高(图1)。

2.2 纯化的 rSj26-Sj32的 SDS-PAGE分析BL21(pET28α-Sj26-Sj32)培养至对数生长期,经IPTG诱导7h的表达产物利用Ni-NTA试剂盒纯化,然后进行 SDS-PAGE电泳,纯化后的 rSj26-Sj32在约69kDa处有明显的蛋白表达条带,其分子量与预期值相符(图2)。

2.3 rSj26-Sj32、SjAWA包被浓度和血清稀释度选择 在进行ELISA实验时,rSj26-Sj32和SjAWA 的包被浓度分别为 0.4μ g/孔和 2μ g/孔时,二者的阳参/阴参的A值之比分别为最大;血清稀释度为1∶50时,其阳性血清吸光度OD450值与正常对照血清OD450值的比值(S/N)最大。因此在进行Dot-ELISA实验时,rSj26-Sj32和SjAWA的包被浓度分别选择0.4μ g/孔和 2μ g/孔,血清稀释度为1∶50。

图1 重组质粒pET28α-Sj26-Sj32表达产物的 SDS-PAGE分析1:蛋白marker;2:未诱导的BL21(pET28α-Sj26-Sj32);3-9:1mmol/L IPTG分别诱导1,3,5,7,9,11和13小时的BL21(pET28α-Sj26GST-Sj32)产物Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant plasmid pET28α-Sj26-Sj32 expression product1:Protein marker;2:BL21(pET28α-Sj26-Sj32)withoutinduction;3-9:BL21(pET28α-Sj26-Sj32)induced with 1mmol/L IPTG for 1,3,5,7,9,11 and 13h

图2 rSj26GST-Sj32蛋白纯化的SDS-PAGE分析1:蛋白marker;2-5:1mmol/L IPTG分别诱导1,3,5和7h的BL21(pET28α-Sj26GST-Sj32)产物 6-9 纯化的rSj26GST-Sj32蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis ofthepurified rSj26GSTSj32 protein1:Protein marker;2-5:BL21(pET28α-Sj26GSTSj32)induced with 1mmol/L IPTG for 1,3,5 and 7h;6-9:Purified rSj26GST-Sj32 protein

2.4 Dot-ELISA检测 rSj26-Sj32和SjAWA检测急性日本血吸虫病患者的阳性率均为100%,二者检出率无差异;特异性分别为 95.35%和93.02%;rSj26-Sj32与华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和泡型棘球蚴病患者血清的交叉反应率分别为9.52%、15.38%和10.00%,SjAWA与华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和泡型棘球蚴病患者血清的交叉反应率分别为14.29%、23.08%和20.00%;两种抗原均与囊型棘球蚴病、乙型肝炎和肺结核病人血清未见交叉反应 (表 1)。rSj26-Sj32-IgG-Dot-ELISA诊断急性日本血吸虫病的阳性预告值、阴性预告值和诊断效率分别为96.15%、100%和97.88%,而SjAWA-IgG-Dot-ELISA诊断急性日本血吸虫病的阳性预告值、阴性预告值和诊断效率分别为94.34%、100%、96.77%。

3 讨 论

Ni-NTA中Ni2+有4个共价键与NTA结合,使得Ni与NTA结合更牢固,脱落率低,可提高蛋白纯度并减少Ni2+脱落造成的环境污染。本研究利用Ni-NTA纯化试剂盒对 BL21(pET28α-Sj26-Sj32)经IPTG诱导7 h后收集的表达产物进行纯化,获得纯化的蛋白浓度为0.21μ g/μ L,同时纯化后的rSj26-Sj32在约69ku处有明显的蛋白表达条带,其浓度和分子量均达到实验要求。

表1 rSj26-Sj32-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值Tab.1 The immunodiagnostic value of rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA on patients with acute schistosomiasis japonica

抗体IgG与日本血吸虫急性感染、慢性感染及再感染关系密切,急性日本血吸虫病人的IgG含量与慢性血吸虫病人相近,均远高于正常人。检测特异性IgG具有较高的诊断价值和部分疗效考核价值〔6-8〕。王志成等〔9〕发现 rSj26对急性日本血吸虫病患者血清检测的阳性率为92%。舒新华等〔10〕用rSj32、SjAWA和SEA分别检测日本血吸虫病、华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病患者和健康人血清,发现rSj32用于检测日本血吸虫病的敏感性和特异性与虫源性抗原AWA和SEA的差异无显著性。与常规ELISA比较,Dot-ELISA反应时间短,重复性好,实验所需血清及酶标抗体用量极少,方法简便,采用室温孵育和肉眼观察判断结果,无需特殊仪器,便于大规模检测。本研究利用获得的rSj26-Sj32建立Dot-ELISA法检测急性日本血吸虫病患者血清发现阳性检出率为100%,与SjAWA的阳性检出率一致,特异性分别为95.35%和93.02%,无显著差异(χ2=0,P＞0.05);rSj26-Sj32和SjAWA均与华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和泡型棘球蚴病患者血清存在不同程度的交叉反应,但无显著差异,提示rSj26-Sj32与SjAWA具有相似的敏感性和特异性,表明rSj26-Sj32融合抗原是一种有价值的诊断抗原,值得扩大样本量进行进一步观察。

阳性预测告值是指在人群中对某种疾病进行筛检时,被试人如为阳性时所患该病的概率。阴性预测值是指在人群中对某种疾病进行筛检时,被试人为阴性时无该病的概率。阳性预测值与诊断试验的灵敏度和特异度有关。诊断试验的特异度越高,阳性预告值越高;诊断试验的灵敏度越高,阴性预测值越高。本研究利用rSj26-Sj32检测急性日本血吸虫病患者的阳性预告值、阴性预测值和诊断效率与SjAWA的相似,二者无显著差异。

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Immunodiagnostic value of rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA for patients with acute Schistosomiasis japonica

WANG Min,LI Wen-gui,CAI Shi-fei,ZHOU Bi-ying
(Instituteof Infectious and Parasitic Diseases,the First Af f iliated Hospital,
Chongqing Medical University,Chongqing400016,China)

To study the immunodiagnostic value of rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA for patients with acute Schistosomiasis japonica,sera from parients were detected by HRP-IgG-Dot-ELISA which established by purified rSj26-Sj32 fusion protein andSchistosoma japonicumadult worm antigen(SjAWA),and compared with detections results of sera from patients with clonorchiasis,paragonimiasis westermani,echinococciasis,hepatitis B and pulmonary tuberculosis,as well as healthy people.It showed that both of the positive rates for rSj26-Sj32 andSjAWA in detection of sera from patients with acute schistosomiasis japonica were 100%,and the specificities were 95.35%and 93.02%,respectively.Moreover,cross reactions different degrees were emerged between sera from patients with clonorchiasis,paragonimiasis westermani and alveolar echinococcosis and both of rSj26-Sj32 andSjAWA.It is suggested that the purified rSj26-Sj32 fusion portein is one of the preferable immunodiagnostic antigen for schistosomiasis japonica.

Schistosomiasis japonica;rSj26-Sj32;Dot-ELISA;immunodiagnosis

R383

A

1002-2694(2010)08-0758-04

*重庆市科委地方病重大专项基金(No.2008AB5055,2008AB5008,2008AB5054)资助

李文桂,Email:Li_wengui@yahoo.com.cn

重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所,重庆 400016

2010-02-23;

2010-05-17