经穴注射骨髓间充质干细胞对缺血大鼠促血管生长相关因子的影响

董建勋，朱朝军，路广林，李 健，张美吉，王乐平，罗 玲

(1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010;2.北京中医药大学，北京 100029)

本文采用免疫组织化学法分析了经穴注射BMMSCs治疗21 d后大鼠后肢缺血骨骼肌VEGF标记的毛细血管密度、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)标记的小动脉密度以及TNF-α和TGF-β1蛋白的表达量，尝试探索VEGF、TNF-α和TGF-β1在血管新生和动脉生成之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)大鼠BM-MSC:SD大鼠BM-MSCs、SD大鼠BM-MSCs完全培养液均购自 Cyagen Biosciences(Guangzhou)Inc。实验动物:SD大鼠24只，体质量200g±20g，雌雄不限，购自北京市维通利华公司，动物许可证号SCXK(京)2007-0001;(2)主要实验设备:MC0175CO:细胞培养箱(SANYO公司)，OLYMPUSix-71倒置显微镜，Nikon C-SHG1图像分析系统;(3)主要试剂:血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转移生长因子-β(TGF-β1)一抗及兔SP Kit一抗为兔来源的免疫组化试剂盒，均购于北京博奥森生物技术有限公司。α-SMA一抗购于美国Abcam公司。

1.2 动物及分组

选择健康SD大鼠24只，适应性喂养3d，称重后随机分对照组、模型组、经穴注射BM-MSC治疗组(经穴组)和肌肉注射BM-MSC治疗组(肌注组)4组。于造模前、后自由进食、饮水，同等条件下饲养。

1.3 动物模型制备

［1］的方法，在无菌操作下麻醉大鼠后(腹腔注射10%水合氯醛，3.5 ml/kg)仰卧固定于鼠板上。自其左腹股沟韧带至膝关节上行一纵行切口，分离股动脉及分支。然后用5-0丝线在近左髂总动脉、腘动脉两处结扎股动脉及分支，从两处结扎的丝线中间离断股动脉及其分支，造成下肢缺血模型，随后缝合皮下组织及皮肤。术后不做抗感染处理。

1.4 治疗方法

经穴组在手术左侧后肢选取“三阴交”、“后三里”、“照海”、“环跳”、“阳陵泉”5个穴位注射 BMMSCs。按照华兴邦等［2］大鼠穴位图谱研制一文中经穴的定位取穴。肌注组在左侧后肢缺血大腿内侧从上至下选取非穴位5点注射BM-MSCs。模型组选取的注射部位同肌注组，注射磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照。术后立即用微量注射器行BMMSC单次注射，注射深度1cm，注射后不做任何手法处理。经穴组、肌注组每只大鼠注射BM-MSC 5×106个，每穴/点注射0.2ml细胞混悬液，含BM-MSC 1×106个，只注射1次。模型组大鼠左侧后肢注射等量的PBS。经穴组、肌注组、模型组3组大鼠右肢体不做任何处理，作为正常对照。空白对照组大鼠不做任何处理。

1.5 α-SMA表达阳性小动脉密度的计算

经穴注射BM-MSCs 21d后，麻醉大鼠后取大鼠后肢内收肌、腓肠肌，甲醛固定标本，石蜡包埋，按肌肉横断面切片厚约5μm(在北京中医药大学基础医学院组胚教研室进行)。用抗平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色标记血管壁上的平滑肌，认为α-SMA表达阳性的部位是小动脉所在。使用Nikon CSHG1图像分析系统(北京中医药大学基础医学院组胚教研室提供)随机选10个视野，在高倍镜(10×40)下计算小动脉的密度，为减少误差用镜下小动脉数/肌束数(小动脉密度)来表示，取其平均值。

1.6 VEGF阳性表达血管的计算

按照博奥森即用型免疫组化试剂盒说明书染色，镜检有棕黄色颗粒为阳性。免疫组织化学VEGF染色，血管内皮细胞胞浆染色呈棕黄色者为阳性细胞，该毛细血管即为VEGF阳性表达的血管。随机选取10个视野，在高倍镜(10×40)下观察计数VEGF阳性表达的血管数，取其平均值。

1.7 TGF-β1和 TNF-α 表达测定

按照博奥森即用型免疫组化试剂盒说明书染色，镜检有棕黄色颗粒为阳性。同时设不加一抗的非特异性对照。采用尼康图像分析仪对免疫组化显色结果进行分析。每组选10个高倍视野(10×40)图片，计算视野中阳性表达的面积(AREA)×平均光密度(MOD)值，取其平均值。

1.8 统计学处理

用SPSS 11.0统计软件对实验数据进行处理。计量资料用±s表示。多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用LSD进行多重比较，多元相关分析采用Pearson检验，以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 小动脉密度及VEGF阳性表达血管数的比较

表1和图1、2显示，正常骨骼肌中，α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体阳性细胞只能在小血管的平滑肌细胞中观察到。结果表明，与对照组比较，肌注组和经穴组小动脉密度指数及VEGF阳性表达的血管数都显著升高 (P<0.01);与模型组比较，经穴组及肌注组小动脉密度指数VEGF阳性表达的血管数均显著升高(P<0.01);与肌注组比较，经穴组小动脉密度指数及VEGF阳性表达的血管数均显著升高(P<0.01)。

表1 各组大鼠缺血后肢骨骼肌横切小动脉密度及VEGF阳性表达血管数(±s)

表1 各组大鼠缺血后肢骨骼肌横切小动脉密度及VEGF阳性表达血管数(±s)

注:与对照组比较，**P<0.01;与模型组比较，▲▲ P<0.01;与肌注组比较，△P<0.05，△△P<0.01

组 别 n 小动脉密度指数 VEGF 阳性表达血管数对照组6 0.85±0.06 9.375±1.19模型组 6 0.90±0.09 10.50 ±1.20肌注组 6 1.40±0.11**▲▲ 17.00 ±2.62**▲▲经穴组 6 1.80±0.07**▲▲△△ 19.875±2.59**▲▲△△

图1 抗α平滑肌肌动蛋白标记的小动脉

图2VEGF标记的毛细血管

2.2 免疫组化学TGF-β1和TNF-α表达量测定

表2、图3、4显示，免疫组织化学法对各组大鼠骨骼肌切片染色，并比较了TGF-β1和TNF-α等蛋白的表达量。结果表明，与模型组比较，经穴组及肌注组 TGF-β1和 TNF-α表达量均显著升高(P<0.01);与肌注组比较，经穴组 TGF-β1和 TNF-α 表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01)。

表2 各组大鼠缺血骨骼肌横切免疫组化TGF-β1和TNF-α表达量测定结果(±s)

表2 各组大鼠缺血骨骼肌横切免疫组化TGF-β1和TNF-α表达量测定结果(±s)

注:与对照组比较:**P<0.01;与模型组比较:▲▲P<0.01;与肌注组比较:△P<0.05△△P<0.01;面积(AREA)×平均光密度(MOD)值

组 别 n TGF-β1 TNF-α对照组6 11.67±1.98 1.98±0.42模型组 6 11.99±4.89 2.55±0.79肌注组 6 20.80±5.03**▲▲ 7.05±2.34**▲▲经穴组 6 25.63±3.23**▲▲△ 11.18±1.78**▲▲△△

图3 各组大鼠缺血骨骼肌横切TGF-β1的表达(免疫组织化学染色，10×40)

图4 各组大鼠缺血骨骼肌横切TNF-α的表达(免疫组织化学染色，10×40)

3 讨论

胚胎发生后，成人的新生血管形成主要有两种机制，一是血管新生，通过局部毛细血管的增生而增加局部的血流量;二是动脉生成，已存在的高阻力侧支血管扩增来减少血流阻力而增加缺血区域的血流量［3］。在血管新生及动脉生成的过程中 VEGF、bFGF、TGF-β1和 TNF-α［4］等血管生长因子发挥重要作用。本研究证实，经穴组a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)表达阳性的小动脉密度和VEGF阳性表达毛细血管密度显著高于肌注组。所以我们认为，经穴注射BM-MSCs改善大鼠后肢血流的过程中，既存在血管新生又存在着肌性动脉形成的动脉生成。

3.1 TGF-β1、TNF-α 与新生血管新成

TNF-a是一种强有力的促血管生成因子，TNF-a通过间接和直接作用促进血管新生。间接作用是通过上调 VEGF、VEGF受体2和 bFGF［5］的表达来实现的，直接作用是通过与bFGF和VEGF共同作用，TNF-a和bFGF以及VEGF等共同诱导人体微血管内皮细胞增生形成毛细血管样管状结构，在此过程中TNF-a能上调促进形成毛细血管结构所必须的尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂的形成［6］。

TGF-β是已知的促血管生长因子，在组织修复、血管形成中起重要作用。TGF-β1是TGF-β家族的主要成员，是调节正常细胞生长和其他各种功能的主要细胞因子。研究表明，TGFβ1可以刺激垂体前叶滤泡星形细胞自分泌和旁分泌碱性成纤维生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，而促进血管新生。更重要的是，TGFβ1对血清剥夺和低氧诱导MSCs的凋亡具有抑制作用，TGF-β还能促进BM-MSCs增殖并较长期保持其生物活性。故MSC分泌的TGFβ1既能减少MSC的凋亡又能促进其增殖，反过来MSC的存活率高又分泌更多的TGFβ1，二者形成良好的相互作用。经穴注射BM-MSCs后，TGFβ1在缺血肌肉组织表达增加，能抑制血清剥夺和低氧诱导BM-MSCs的凋亡，并且促进BM-MSC增殖并较长期保持其生物活性，从而提高注射的BMMSCs存活率，使得更多的 BM-MSCs分泌 VEGF、bFGF和TGFβ1，发挥治疗性血管生成的作用。

3.2 相关血管生长因子在新生血管形成中的相互作用

前期研究表明，经穴注射BM-MSCs能显著提高血浆和免疫组化VEGF、bFGF蛋白表达量。在血管新生过程中，VEGF与bFGF存在相互作用，统计学多元相关分析表明，VEGF(R=0.898，P<0.01)和bFGF(R=0.813，P<0.05)免疫组化蛋白表达量都与小动脉密度显著相关，VEGF和bFGF免疫组化蛋白表达量也显著相关(R=0.955，P<0.01)。有研究表明，VEGF是bFGF发挥作用的基础，Seghezzi等用VEGF抗体中和VEGF就能抑制bFGF诱导的血管生成，他们还提出bFGF主要通过细胞的自分泌和旁分泌途径上调VEGF在内皮细胞中的表达，故本实验血管生长过程中也存在bFGF与VEGF的协同作用。此外，TGF-β1和 TNF-α也都与 VEGF和bFGF之间存在相互作用。

TNF-α能与bFGF和VEGF通过直接或间接作用参与新生血管形成。而TGFβ1可以刺激成纤维生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的分泌，还通过抑制 BM-MSCs的凋亡产生更多的bFGF和VEGF而促进血管新生。故经穴注射BMMSCs能显著增加后肢缺血大鼠小动脉密度和VEGF阳性表达毛细血管密度。

经穴注射 BM-MSCs后，产生更多的 VEGF、bFGF、TGFβ1和 TNF-a，4 种血管生长因子协同作用，TGFβ1既能提高BM-MSCs的存活率，又能上调VEGF、bFGF的表达和注射 MSCs分泌的 VEGF、bFGF共同促进血管新生、动脉生成，所以经穴注射BM-MSCs较肌内注射BM-MSCs能显著提高小动脉密度及VEGF阳性表达毛细血管密度。

总之，经穴注射BM-MSC，调畅经络之气血，濡养三阴、三阳之经脉，滋养神经组织，通过对躯体伤害性传入的抑制效应达到镇痛效果，从而使缺血肢体气血调和、脉络通畅，症状得以缓解。从现代医学讲，(1)经穴注射BM-MSCs可以产生更多的VEGF、bFGF、TGFβ1和 TNF-α等多种血管生长因子，从而促进血管新生和动脉生成;(2)可以产生更多的TGFβ1抑制BM-MSCs的凋亡并且促进其增殖;(3)可以通过分泌的VEGF促进神经突触延伸，发挥神经保护和神经新生作用，减轻缺血缺氧对下肢周围神经的损害，从而减轻症状。简而言之，经穴注射BM-MSCs，可以产生更多的 VEGF、bFGF、TGFβ1和TNF-α等多种血管生长因子，更好地发挥BM-MSCs的新生血管形成作用。

参考文献:

［1］Oju J，Su J S，Suk HB，et al.Additive effect of endothelial progenitor cell mobilization and bone marrow mononuclear cell transplantation on angiogenesis in mouse ischemic limbs［J］.Journal of Biomedical Science，2007，14:323 – 330.

［2］华兴邦，李辞蓉，周浩良，等.大鼠穴位图谱的研制.实验动物与动物实验，1991，1:1-5.

［3］Kinnaird T，Stabile E，Burnett MS，et al.Bone Marrow – Derived Cells for enhancing collateral development:mechanisms，animal data，and initial clinical experiences［J］.Circ Res，2004，95:354-363.

［4］谷涌泉，张建，许樟荣，等.糖尿病足诊疗新进展［M］.北京:人民卫生出版社，2006.268-269.

［5］Tiina T.Tuomisto，Tuomas T.Rissanen，Ismo Vajanto.HIFVEGF-VEGFR-2，TNF-α and IGF pathways are upregulated in critical human skeletal muscle ischemia as studied with DNA array［J］.Atherosclerosis，2004，174:111 – 120.

［6］Enrico Giraudo，Luca Primo，Enrica Audero，ec al.Tumor Necrosis Factor-a Regulates Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 and of Its Co-receptor Neuropilin-1 in Human Vascular Endothelial Cells［J］.J Biol Chem，1998，273(34):22128–22135.