应用10对引物多重PCR方法检测DMD基因缺失

林长坤，姜懿凌，王谦，曹东华，崔婉婷，金春莲

（中国医科大学 1.基础医学院医学遗传学教研室；2.第91期7年制临床医学专业，沈阳 110001）

Duchenne型进行性肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种较常见的X连锁隐性遗传病，其发病率约为活产男婴的1/3 500，临床表现以肌肉的进行性萎缩和无力为特征。该病发病早，进展快，患者多于20岁前死亡。目前尚无有效的治疗方法，只能通过对高风险胎儿进行产前基因诊断，以杜绝患儿的出生。致病基因肌营养不良蛋白基因定位于X染色体短臂（Xp21.1-3），它是目前已知的人类最大的基因，全长约为2.4 Mb，由79个外显子和78个内含子构成，具有较高频率的突变。在所有突变中，基因缺失最为常见，约占55%～65%，基因重复占5%～10%，点突变占25%左右。基因缺失主要见于2个缺失热区：5′端的第4～21外显子（占缺失的20%）及第44～52外显子（占缺失的54%～60%）。近年来，Chamberlain 等［1］、Beggs等［2］、Abbs等［3］在2个缺失热点区设计了外显子引物，建立了检测本病基因缺失的多重PCR方法。我们在DMD基因缺失热点区域外显子45～53和外显子12～19之间，根据文献选取10对引物，首次对我国东北地区55例DMD患者进行了肌营养不良蛋白基因缺失检测，并建立了10对引物的多重PCR方法，研究了基因缺失规律，探讨了改进措施，从而进一步完善了DMD的基因诊断方法。

1 材料与方法

1.1 材料

55例DMD患者均来自我国东北地区，由中国医科大学附属盛京医院发育儿科门诊确诊，均具有典型的临床表现，并经肌电图、血清肌酸磷酸激酶检查确诊。全部患者均为男性，年龄5～14岁，平均7岁。另选取正常健康者5例作为对照。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取方法：抽取患者及正常对照者外周血3 ml，采用饱和氯化钠方法［4］提取DNA。

1.2.2 多重PCR扩增及电泳检测及结果判定：根据文献［1～3］提供的引物序列，由上海生工生物工程公司合成肌营养不良蛋白基因缺失热点区第45、19、51、12、50、13、53、47、42、52 外显子的 10 对引物（表1）。分别将患者和正常人的DNA进行多重PCR扩增，PCR反应体系为50 μl，其中包含模板DNA 500 ng，0.4 mmol/L dNTPs，每对引物各 0.5 μmol/L，5 U Taq DNA聚合酶，对应的2.5×缓冲溶液。循环条件为95℃预变性3 min，94℃变性50 s，57℃复性45 s，72℃延伸60 s，进行35次循环，最后72℃延伸10 min。取15 μl扩增产物，在12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电泳条件为1×TBE电泳缓冲溶液、80 V、电泳2.5 h，以100 bp DNA Ladder作为分子量参照。EB染色后，在紫外灯下观察结果并照相。与正常人DNA扩增产物进行比较，无特异性扩增条带者判定为基因缺失，对未见到扩增条带的外显子进行再次多重PCR扩增以验证缺失结果，若结果相同，即未见到特异性扩增条带者则判定为肌营养不良蛋白基因外显子缺失。

表1 10对多重PCR引物序列及PCR产物片段大小Tab.1 The primers′sequences and product size of multiplex-PCR for the detection of DMD gene deletion

2 结果

如图1所示，10对外显子引物在同一个PCR反应体系中可同时扩增出10个特异性片段，并且扩增产物电泳条带清晰，易于判断。在检测的55例DMD患者中，28例（50.9%）存在外显子缺失，27例（49.1%）未检测到缺失；25例缺失片段集中于第45～53外显子，3例缺失片段集中于第12～19外显子。第50外显子缺失频率最高，其次为外显子45、47、51、52，再次之为外显子 12、53；而外显子 13、19缺失频率较低，未检测到外显子42的缺失。外显子缺失数见表2。

3 讨论

我们在前期研究中，曾应用3×4对引物（共12对）的多重PCR方法进行了DMD的基因诊断，发现DMD患者肌营养不良蛋白基因外显子的缺失绝大部分位于中央区的缺失热点区域，其中外显子45～53缺失约占总缺失的67.8%［5］，因此，将此区域的多个外显子组合为1组，首先对DMD患者进行缺失检测，如果这些引物检测到至少有1个外显子的缺失，就可诊断为缺失型DMD；如果这些引物未检测到缺失，再选择其它引物组合（外显子8～19）对其它外显子进行检测可进一步明确DMD诊断。这样既能降低成本，又能快速做出DMD的基因诊断。本研究从肌营养不良蛋白基因的缺失热区（外显子12～19，42～53）选取了 10 对引物，应用多重 PCR 技术首次对55例东北地区DMD患者进行了肌营养不良蛋白基因缺失检测。结果显示，至少有1个外显子缺失的患者28例，占总数的50.9%；27例未检测到缺失，占49.1%。肌营养不良蛋白基因缺失主要分布于2个外显子缺失的热点区内：25例缺失片段位于第45～53外显子，3例缺失片段位于第12～19外显子。第50外显子缺失频率最高，其次为外显子45、47、51、52，再次为外显子 12、53，而外显子 13、19最低，未检测到外显子42的缺失。本研究中DMD患者的外显子缺失片段分布规律与文献报道基本一致，符合缺失热点区域的分布规律。本文建立的10对多重PCR方法与应用3×4对引物的多重PCR方法相比，检测结果一致，而操作上更为简便，能够快速有效的检测出DMD基因缺失热点区域的绝大部分外显子的缺失，并进一步明确了缺失范围，为下一步诊断工作节省了时间。另外，选取DMD基因缺失2 个热点区域（外显子 12～19，42～53）的引物互为内对照，避免了因操作所造成的假阴性结果，同时各外显子的电泳条带也更容易判断。

表2 缺失外显子分布统计Tab.2 The deletion status of exons

本研究检测了多个参数来优化10对引物的多重PCR方法，以获得高特异性的、高产量的扩增产物。首先，选择组合的引物长度相差最小为30 bp左右，以确保扩增的10个特异性PCR产物电泳条带清晰、易于判断；其次，调整PCR反应体系中的缓冲溶液、DNA聚合酶、dNTPs、引物的浓度，以达到最大的扩增效率，避免了因操作所造成的假阴性结果而误诊。研究结果表明，10对PCR引物的组合可在同一个PCR循环条件下、同一个反应管中快速扩增出所有目的条带（PCR反应仅需几个小时，而DNA印迹杂交则一般需要1～2周）；操作简便、经济实用（只需常规PCR试剂，费用低、无放射性污染）；能有效检测出高频缺失外显子（45～53，8～19）的特异性片段。10对多重PCR方法的建立更加完善了现有的检测方法，更有利于达到预防患儿出生的目的，对提高我国人口素质，优生优育具有重要意义。

［1］Chamberlain JS，Gibbs RA，Ranier JE，et al.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification［J］.Nucleic Acids Res，1988，16（23）：11141-11156.

［2］Beggs AH，Koenig M，Boyce FM，et al.Detection of 98%of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction ［J］.Hum Genet，1990，86（1）：45-48.

［3］Abb S，Yan SC，Clark S，et al.A convenient multiplex PCR system for the detection of dystrophin gene deletions ［J］.J Med Genet，1991，28（10）：304-311.

［4］林长坤，姜莉，张励，等.一种实用的基因组DNA提取方法及其应用［J］.中国医科大学学报，1998，27（4）：440-442.

［5］鲁阳，金春莲，林长坤，等.东北地区抗肌营养不良蛋白基因缺失的研究及应用［J］.遗传学报，2004，31（5）：449-453.