菜籽多糖研究进展

朱建飞，严奉伟，吴谋成

（1.重庆工商大学环境与生物工程学院，绿色食品研究所，重庆400067；2.长江大学生命科学学院，湖北荆州434025；3.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

菜籽多糖研究进展

朱建飞1，严奉伟2，吴谋成3

（1.重庆工商大学环境与生物工程学院，绿色食品研究所，重庆400067；2.长江大学生命科学学院，湖北荆州434025；3.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

对有关菜籽多糖的国内外研究状况进行了较全面的综述，涉及多糖的制备工艺、结构表征及功能活性等方面。

菜籽多糖，制备工艺，结构表征，功能活性

油菜是一种重要的油料作物，我国油菜籽产量居世界第一位。每年油菜籽制油后所产生的菜籽粕达600～700万t［1-2］。菜籽粕中含有蛋白质、酚类化合物、植酸、多糖等成分，很多研究表明，这些成分都具有较高利用价值［3-7］。本文探讨了菜籽多糖的研究进展。

1 菜籽多糖的制备工艺

要想获得多糖纯品，一般都要经过以下步骤：a.预处理，对菜籽预处理以利于提取并增加菜籽多糖的提取得率并且减少提取过程中杂质的混入；b.提取，通过不同方法将菜籽多糖从预处理后的菜籽粕中提取出来；c.分离，采用不同处理手段将大量非多糖类物质除去；d.纯化，采用各种不同方法将多糖均一性组分纯化出来。

1.1 预处理

首先将菜籽粕进行粉碎处理以利于后续的提取工艺。然后就是对菜籽进行脱脂处理，通常以石油醚、乙醚、乙醇、丙酮等作为脱脂剂，如果是已经过充分榨油处理的脱脂菜籽粕则无需此过程。由于菜籽粕中富含单糖、双糖、低聚糖、酚类等小分子物质，为了减少提取多糖的过程中这些物质的混入，需要进行去除小分子的前处理。Aspinall等［8］从菜籽壳中提取果胶类多糖时，依次采用石油醚、丙酮、80%乙醇等对菜籽壳进行前处理。Partha等［9］依次用正己烷浸泡48h、丙酮浸泡24h等前处理得到的菜籽粕作为多糖提取的原料。

1.2 菜籽多糖的提取

最初，菜籽粕被当作果胶类物质的提取原料，以CDTA［10］、EDTA［11］、草酸铵［8］等为螯合剂，从菜籽中提取果胶类物质。而对于半纤维素多糖，由于未发现其利用价值，因此相关研究则未受到重视。Aspinall等将提取果胶后的菜籽粕经脱木质素处理，以氢氧化钠-四硼酸钠（硼砂）溶液为提取溶剂，得到一种富含木葡聚糖的多糖组分。Siddiqui等［10-13］采用水溶液、NaOH溶液为提取剂，从脱壳菜籽粕中提取了半纤维素多糖。Eriksson等［14］对脱壳菜籽采用热水浸提，通过一系列工艺，得到水溶性以及水不溶性多糖。Partha等［8］将菜籽粕依次以0.05mol/L HCl溶液、0.05mol/L KOH+0.4%NaBH4溶液、1mol/L KOH+0.4%NaBH4溶液、KOH+0.4%NaBH4溶液得到了一系列的菜籽多糖组分；同时作者也采用经典的β-葡糖基Yariv试剂法，通过特异性结合反应从菜籽粕中分离得到阿拉伯半乳糖蛋白。朱建飞等［15-16］用水按液料比为28∶1（mL/g）在94℃浸提2.9h，一次提取菜籽多糖得率为2.18%，连续提取三次将水溶性多糖提取殆尽。剩余的残渣料再以5% NaOH溶液作提取剂，按料液比1∶20，60℃提取2h，得到的提取液以4mol/L HCl溶液中和pH至5，得到水溶性多糖WPS和碱溶性多糖APS。

1.3 菜籽多糖的纯化

Eriksson等［10］通过DEAE-Sephadex CL-6B离子交换柱（8×1.6cm）层析，以0.05～2.0mol/L的醋酸盐缓冲液（pH4.8）梯度洗脱，得到纯化的果胶类物质。Aspinall等［8］将以草酸铵、EDTA-Na2为螯合剂提取的不同粗果胶，过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析柱，以0.2mol/L甲酸钠溶液作为洗脱液，得到纯化的菜籽壳果胶。之后，Aspinall等［17］又将以EDTA-Na2为螯合剂提取的粗果胶，通过三次DEAE -Sephadex A50柱层析，然后加入费林试液进行分级，接着通过滴加0.2mol/L盐酸溶液，乙醇沉淀，最终得到木葡聚糖纯品。Eriksson等［14］采用快速蛋白液相色谱（FRLC）系统，将水溶性菜籽粗多糖过Fractogel TSK HW-75（S）柱，通过折光率（RI）和254nm紫外检测，经过糖分析收集主峰。收集物通过透析、冷冻干燥，如此反复过柱10次，得到纯化多糖。朱建飞等［16，18］将水溶性多糖和碱溶性多糖初提物分别经筛选出的特1号大孔吸附树脂柱层析、分步醇沉、DE-52纤维素离子交换柱层析等方法纯化，分别得到各自的主要级分WPS-1和APS-2，经纯度鉴定均为相对均一多糖。

2 菜籽多糖的组成结构表征

对于菜籽多糖的组成分析，早期普遍都是采用乙酰化多糖水解产物进行GC、GC-MS分析，并采用FT-IR对多糖的官能团进行初步鉴定。而对于菜籽多糖结构的研究，主要是Aspinall等和Siddiqui等这两个课题组采用利用甲基化反应研究菜籽多糖各单糖残基的连接方式。Siddiqui等［12］研究了一种水溶性菜籽多糖结构。从甲基化数据推出，多糖的平均单元是有25个糖残基组成，其中有9个非还原末端，包括3个Gal残基、5个Xyl残基、1个Guc残基；支链有8个Glc残基（通过4，6位）；剩余的8个非末端残基由2个（1→6）-Glc、1个（1→2）-Xyl、5个（1→4）-Glc残基组成。随后，Siddiqui等［13］又从菜籽中分离得到了一种酸性的阿拉伯半乳聚糖，包含Ara、Gal、GlcA（摩尔比为1∶1.05∶0.13）。甲基化结果显示酸性阿拉伯半乳聚糖分子是一个多分支的结构，重复的结构单元是由45个糖残基组成，具体如下：1个Gal的非还原末端、14个 Ara的非还原末端、3个GalA的非还原末端、13个（1→3，6）-Gal、1个（1→2，5）-Ara、2个（1→3，4，6）-Gal；存在的11个非末端残基包括2个（1→6）-Gal，4个（1→3）-Gal、5个（1→5）-Ara。Aspinall等（1974）从菜籽壳中提取的果胶，酯化度为83%，包含76%的己糖醛酸（主要是GalA）、2%～3%的Gal、8%～9%的Ara、2%的Xyl、2%～3%的Rha、1%的Fuc。主要的果胶级分水解后，其糖醇乙酸酯GC分析表明存在Rha、Fuc、Ara、Xyl、Gal（摩尔比分别为4∶1∶18∶3.7∶2.1）。Aspinall等［17］研究了从菜籽壳中分离的一种碱溶性多糖的结构，衍生化后通过GC-MS分析，结果表明该多糖由Ara、Fuc、Xyl、Gal和Glc，其摩尔比为2∶8∶25∶13∶52，结果表明，多糖是由许多的木葡聚糖组成，另外一些支链上还有一些Fuc、Gal末端残基。Siddiqui等［10］研究了一种碱溶性菜籽多糖的结构，其单糖组成包括Gal、Glc、Xyl、Guc，摩尔比分别为3∶14∶10∶2。甲基化研究显示多糖含有高支链结构。甲基化分析表明，平均每33个糖残基中，含有11个非还原末端（8个Xyl、2个Fuc和1个Gal），支链中有11～12个（1→4，6）-Glc残基，余下的8个非末端残基由2个（1→2）-Xyl、4个（1→4）-Glc和2个（1→2）-Gal组成。

直到90年代中期，核磁共振（NMR）等先进技术才被用于菜籽多糖的结构分析。Eriksson等［14］研究了富含Ara和Gal（Ara/Gal为5.4）的菜籽多糖的结构，通过甲基化分析，以及几种NMR，包括一维核磁共振分析（1D NMR），如一维核磁共振氢谱（1D1H NMR）、一维核磁共振碳谱（1D13C NMR），二维核磁共振分析（2D NMR），如1H，13C HMQC谱、NOESY谱、1H，1H COSY谱。结果分析表明该多糖主要是一个阿拉伯聚糖组分。含有（1→5）键（A）或（1→2）键（B）位异头碳的Ara基团，和（1→5）键（D）或（1→2）键（C）位异头碳的2，5位被相邻Ara基取代的Ara残基。A、B、C、D摩尔比为2∶1∶1∶1。Partha等［9］采用三甲基硅烷（TMS）衍生化GC法分离鉴定多糖组分，并多糖结构鉴定采用的分析方法包括体积排阻色谱（SEC）、配有脉冲安培检测器的高效阴离子交换色谱（HPAE-PAD）以及质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。作者采用木聚糖内切酶处理多糖组分4OH-M，并对酶处理后的低聚物（命名为M4Xose）进行组成分析，发现有少量的葡萄糖，以及痕量的其他糖类包括4-O-甲基-葡萄糖醛酸（4-O-Me-GlcA）。进一步用HPAE-PAD分析表明，M4Xose含有Xyl（27%）和木二糖（26%）。MALDITOF MS法分析木聚糖酶水解得到的寡聚物，显示有多种不同的酸性片段存在。根据荷质比推断出有Xyl4-4-O-Me-GlcA、Xyl5-4-O-Me-GlcA、Xyl6-4-O-Me-GlcA、Xyl7-4-O-Me-GlcA和Xyl6-GlcA。用（1→4）-β-葡萄糖外切酶为木糖葡聚糖降解酶，处理多糖组分4OH-M，产生的低聚糖通过甲基化分析表明，存在末端木糖（T-Xyl）、T-Fuc、T-Gal、（1→2）-Xyl、（1→2）-Gal、（1→6）-Glc和（1→4，6）-Glc残基。研究结果显示，脱脂菜籽粕中主要的非纤维素多糖是阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳糖蛋白、鼠李半乳聚糖I和半纤维素聚合物。这是作者首次发现脱脂菜籽粕含有阿拉伯半乳聚糖（一类具有药理学和食品工业应用价值的植物蛋白多糖）。朱建飞等［16，19］采用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法（GC）和1-苯基-3 -甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色谱法（HPLC）测定单糖组分，得出菜籽多糖级分WPS-1主要由Ara组成，还含有少量的Gal，Glc等单糖。对比通过甲基化分析以及一维NMR（包括13C NMR和1H NMR）对菜籽多糖级分WPS-1的结构表征进行了研究，得出WPS-1的主体部分主要是由（1→5）键和（1→2）键连接的Ara残基组成的多支链α-阿拉伯聚糖，同 Eriksson等［14］的研究结果非常相似。

3 菜籽多糖的功能活性研究

在国内，仅本实验室对菜籽多糖的生物活性进行了初步研究，发现其具有抗氧化、抑瘤等作用。严奉伟等［20］研究菜籽多糖粗品的抗氧化作用与机理。用K3［Fe（CN）6］与TCA体系、脂肪氧合酶评价菜籽多糖的还原能力及抑制脂肪氧合酶的能力，用丙二醛（MDA）及活性氧（ROS）试剂盒测定MDA及ROS含量，用分光光度法测定小鼠肝线粒体肿胀度。结果显示，在化学模拟体系中，菜籽多糖具有还原能力，2.00mg·mL-1菜籽多糖的抗活性氧单位为94.03，对脂肪氧合酶的抑制率达 22.8%。在体外，2.00mg·mL-1菜籽多糖使自由基诱导的小鼠肝线粒体肿胀度低于非诱导组，对自由基诱导的小鼠肝线粒体MDA生成抑制率达30.3%，对肝组织匀浆MDA生成抑制率分别为54.7%（非诱导组）、32.0%（Fe2+诱导组）及84.5%（H2O2诱导组）。10.00mg·mL-1菜籽多糖使小鼠血清抗活性氧单位达1340.13。在体内，腹膜注射菜籽多糖组小鼠（400mg·mL-1bw·d-1，12d）与对照组相比，肝匀浆MDA的降低达到极显著水平（P＜0.01）。结果表明，菜籽多糖在体内外均具有明显的抗氧化作用，菜籽多糖具有还原能力及抑制与氧化有关的酶的活性可能是其抗氧化的机理。

严奉伟等［21］研究了菜籽多糖的抑瘤作用及其机理。通过接种S180细胞复制荷S180瘤小鼠模型，分别腹膜注射生理盐水、环磷酰胺、菜籽多糖，测定各组小鼠肿瘤重量与脏器指数、免疫能力、抗氧化能力、乳酸脱氢酶活力等指标。结果表明，50～200mg/kg·d的RSPS抑瘤率在20.66%～34.710%之间；RSPS能显著提高荷瘤小鼠脾脏指数、腹腔巨噬细胞吞噬率与吞噬指数、迟发性超敏反应、小鼠血清溶血素含量与脾细胞抗体形成等指标，显著抑制荷S180小鼠血清LDH的活性，提高红细胞CAT活性，降低血清溶血素MDA含量。以上结果表明，RSPS在小鼠体内具有抑制S180肉瘤的作用，能增进荷瘤小鼠免疫力、清除自由基与抑制LDH活性可能是其抑制肿瘤的机理。

严奉伟等（2007）研究菜籽多糖（RSPS）在四氧嘧啶致糖尿病小鼠体内的降血糖作用。发现菜籽多糖能显著降低糖尿病小鼠血糖水平，增加糖尿病小鼠胸腺与脾脏指数，提高血清抗活性氧单位，降低肝匀浆MDA含量。

朱建飞等［16，19］系统研究了菜籽多糖的体外活性。分别采用邻苯三酚-鲁米诺、硫酸铜-邻菲啰啉-抗坏血酸-双氧水、鲁米诺-双氧水三种化学发光体系，通过微弱发光测量仪测定了菜籽多糖WPS-1和APS-2对超氧阴离子（·）、羟基自由基（·OH）和双氧水（H2O2）三种ROS的体外清除作用。结果表明，WPS-1和APS-2对各ROS都有良好的体外清除作用，且都呈剂量-效果关系。WPS-1和APS-2在实验最高浓度2000μg/mL时，对·的极大抑制率分别为90.4%和89.6%。WPS-1和APS-2对·的半数抑制浓度（IC50）分别为400±44μg/mL和450 ±64μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除·能力。WPS-1和APS-2在实验最高浓度1000μg/mL时，其对·OH的极大抑制率分别为 93.8%和86.7%。WPS-1和APS-2对·OH的IC50分别为240 ±18μg/mL和293±24μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除·OH的能力。WPS-1和APS-2在实验最高浓度50μg/mL时，其对H2O2的极大抑制率分别为84.2%和85.2%。WPS-1和APS-2对H2O2的IC50分别为 10.0±0.8μg/mL和 6.1±0.5μg/mL。APS-2清除H2O2的能力略强于WPS-1。比较IC50值，WPS-1和APS-2对各自由基的清除能力都表现为：H2O2＞·OH＞O-2·。

朱建飞等［19］采用尼龙毛柱法从脾淋巴细胞分离T、B淋巴细胞。通过MTT法检测，发现菜籽多糖对总脾淋巴细胞和T淋巴细胞具有明显的增殖活性，并表现出明显的剂量-效果关系，增殖的最佳浓度为40μg/mL，并且WPS-1比APS-2作用效果更好。采用半定量RT-PCR进一步研究菜籽多糖WPS-1对T淋巴细胞分泌的细胞因子白细胞介素2（IL-2）、IL-4、IL-6、干扰素γ（IFN-γ）mRNA表达的影响。首先研究了各细胞因子mRNA随WPS-1作用时间的变化，WPS-1促进IL-2、IL-4、IL-6 mRNA表达最佳作用时间都为24h，而促进IFN-γ mRNA表达的最佳作用时间为12h。采用各细胞因子mRNA表达的最佳作用时间，进一步考察WPS-1浓度的影响，得到其对促进IL-2、IL-6、IFN-γ mRNA表达的最佳浓度都为40μg/mL，而对IL-4则为20μg/mL。菜籽多糖可能对淋巴细胞的免疫功能具有调节作用。

朱建飞等［19］采用MTT法检测细胞的活性，发现菜籽多糖能促进巨噬细胞增殖，并表现出明显的剂量-效果关系，菜籽多糖促进巨噬细胞增殖的最佳浓度为40μg/mL，WPS-1比APS-2对巨噬细胞增殖活性的促进作用略大。菜籽多糖对巨噬细胞的影响与对T淋巴细胞的检测结果相类似。采用半定量RT-PCR进一步研究不同作用时间下40μg/mL菜籽多糖WPS-1对腹腔巨噬细胞IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）这两种细胞因子以及诱生型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达的影响。WPS-1对腹腔巨噬细胞IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达量最大的时间为24h。菜籽多糖可能对巨噬细胞的免疫功能具有调节作用。

4 展望

菜籽多糖作为菜籽粕综合利用研究中发现的具有开发利用价值的又一种生物活性物质，国内对于菜籽多糖的研究起步较晚，近几年才从本实验室开始。对其生产工艺、结构鉴定和生物活性已有初步探讨，但还有待于进一步深入研究，为菜籽多糖的应用奠定基础。

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Research progress in rapeseed polysaccharides

ZHU Jian-fei1，YAN Feng-wei2，WU Mou-cheng3
（1.College of Environmental and Biological Engineering，Natural and Health Food Research Institute，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China；2.College of Life Science，Changjiang University，Jingzhou 434025，China；3.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

The study on rapeseed polysaccharides at home and abroad were discussed comprehensively，including the preparation technology，structural characterization and bioactive activity of rapeseed polysaccharides.

rapeseed polysaccharides；preparation technology；structural characterization；bioactive activity

TS201.2+3

A

1002-0306（2010）12-0366-04

2009-11-13

朱建飞（1979-），男，讲师，博士，研究方向：农业资源综合利用。

国家“十五”重大科技专项资助项目（2001BA501A20）。