肺炎衣原体的发现、传播和检出

张 莉,黄伟忠,张国良

肺炎衣原体的致病性非常广泛[1],作为人类疾病的病原体在过去 30多年来已经报道的致病性涉及广泛,呼吸系统有咽喉炎、哮喘、支气管炎和社区获得性肺炎;心血管系统有心肌炎、心内膜炎、动脉硬化和冠心病;其他系统有虹膜炎、肝炎、脑膜炎、结节性红斑和关节炎等。

空气中密布肺炎衣原体,因此,急性感染率和慢性感染率非常高。症状有严重及轻微,甚至不被察觉,且大都与感冒相似而被忽视,症状的不典型使诊断非常困难。

1 肺炎衣原体的发现

1965年预防接种中,从台湾 1个儿童眼部第一次分离出肺炎衣原体毒株,命名 TW-183。十多年后的 1983年在美国西雅图患急性咽喉炎的大学生的咽喉拭子中又分离出另 1毒株,命名 AR-39。由于两者从培养特征到包涵体结构颇相似于鹦鹉热衣原体,故合并后 TWAR,属鹦鹉热衣原体种。

其后几年,陆续在西雅图、芬兰、英国及世界各地的急性呼吸道感染患者咽拭子中分离出众多毒株,依照 TWAR的超微结构、DNA与 RNA组成、同源性、血清学特征等,均与鹦鹉热衣原体显著地不同。Grayston等[2]于 1989年提出将TWAR命名为一个新种:肺炎衣原体。其后得到国际的验证及承认。

肺炎衣原体是介于病毒与细菌之间的专属细胞内寄生的病原体。在宿主细胞内生长、繁殖和形成包涵体。包涵体大小在1～5μm之间,其中有:原生体 (elementary Body,EB)主要呈梨形,也有呈球形,大小在 0.1～1.0μm之间;网状体 (reticulate Body,RB)主要呈圆形,大小在 0.5μm左右;中间体(intermediate Body,IB),形态不一,大小介于上述两者之间。只有原生体对人类才有侵袭力和毒力,构成传染源。

2 肺炎衣原体的传播途径

肺炎衣原体感染是一个呼吸道传播的传染病。传播途径是通过肺炎衣原体患者的飞沫或喷嚏,被健康人呼吸入呼吸道。肺炎衣原体在后者呼吸道细胞里生长、繁殖及侵袭,从而造成感染状态。

肺炎衣原体是一个严格细胞内寄生的革兰氏阴性小球菌。它不能独立生活,必须依赖宿主细胞的能量和营养才能自我生长、繁殖。肺炎衣原体有它独特的生活周期:健康人通过飞沫吸入肺炎衣原体原生体→进入健康者的呼吸道,并被巨噬细胞吞饮,这个过程大约需 2～5h→原生体在巨噬细胞里若未被破坏而得以生存后,在细胞浆里发育成空泡样结构,称中间体,这个过程大概 10h→中间体吸取寄生细胞的能量,开始分裂、繁殖,生长出数量不等的新的小体,其形态似网状,故名网状体→在巨噬细胞的细胞浆里经过多次的反复分裂、繁殖和增大,同时存在原生体、中间体和网状体 3种小体,并有胞膜包裹,呈现形态不规则的多形性及多样性。这时称这种结构为肺炎衣原体包涵体 (inclusion bodies)。从肺炎衣原体原生体入侵人体到形成包涵体大概需 3～4d,这段期间为感染的潜伏期→随后,包涵体内容物即原生体、中间体和网状体继续生长、分裂和增大,使包涵体的胞膜破裂。巨噬细胞的细胞膜也破裂,数以百万计的成熟 EB释放出寄生的细胞,再次侵入宿主的健康组织和细胞或通过咳嗽排出体外,感染健康人群,造成新的的感染。

人类肺炎衣原体感染呈世界性流行,不分地域、种族和年龄限制。一年四季均可能发生,不呈季节性特征。流行可呈散发性或爆发性传播,尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所。所谓社区获得性肺炎 (Community Acquired Pneumonia,CAP)是指医院外罹患感染导致的肺实质、肺泡壁、肺间质的炎症,包括入院后具有平均潜伏期内发生的肺炎 (以区分院内感染性肺炎)[3]。社区获得性肺炎是威胁人类健康的重要疾病,尤其是老年患者。

肺炎衣原体感染的社区获得性肺炎一般症状较轻[4],通常以咽喉痛、声音粗哑等,数天后出现咳嗽、发烧、肺部可有或无异常呼吸音或啰音,末梢血白细胞计数可有正常,X-线检查可有或无阴影,也有报道严重者出现大片均质浸润表现。轻重不一的干咳迁延数周、数月不愈。

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3 肺炎衣原体的实验室检出

临床依据患者的症状和体征,很难鉴别细菌性、病毒性、肺炎支原体或肺炎衣原体的感染,以致在临床用药上存在困难,一般只能依赖实验室通过人体体液标本进行病因检测。

3.1 免疫荧光标记检测法 人体感染肺炎衣原体后经短暂的潜伏期,开始出现轻重不一的临床症状,像感冒一样头痛、鼻涕、咽痛、伴或不伴低烧。在未经治疗用药之前以拭子 (要求使用亚麻、涤纶头的拭子)取黏膜表层细胞,然后涂片,再以荧光标记的抗肺炎衣原体单克隆抗体的荧光素染色,在荧光显微镜下观察,可见到针尖大小、翠绿色的荧光颗粒,此为直接免疫荧光法 (direct immuno-fluorescence,DIF)。取材部位和标本除鼻咽部的粘膜表层细胞外,还有深部痰液、肺泡灌洗液、阴道分泌物、尿道黏液等。检测的阳性率取决于人群的感染期、取材时机、取材技巧及镜下判断经验等因素。

1996年国际肺炎衣原体专家组协商会议,就肺炎衣原体作为病原体的致病性概况、作用及实验室诊断等各个方面达成共识。提出微量免疫荧光法是目前血清学诊断肺炎衣原体感染的最普通、特异、敏感的方法。

间接微量免疫荧光法 (Micro-Immunofluorescent Assay,MIF)由于经过放大 5～10倍,提高了检出的敏感性。检测原理是,用肺炎衣原体感染的细胞如 HEp-2为抗原,固定在玻璃片上,滴加待检的血清 (抗体)标本,再加入荧光素 (一般异硫氰酸荧光黄,FITC)标记的抗人球蛋白,在荧光显微镜下观察最高稀释度的血清出现翠绿色荧光小点为阳性效价。该法操作简易,设备普通,被国际会议推荐常规应用。国际推荐标准是:(1)急性期感染为 2次效价达 4倍或以上或单次IgM≥1∶16;或 IgG≥1∶512者;(2)既往感染为 IgM≤1∶16,或 IgG在 1∶16～1∶256之间者;(3)再次感染为 IgG在 1～2周效价迅速升高,IgM不出现或弱者。当 IgM阳性判断时需排除类风湿因子的干扰。

3.2 多聚酶链反应检测法 很多工作者应用 PCR法检测肺炎衣原体研究[5]。不同研究者使用不同的保守区酶切点设计的引物不同,扩增产物的核苷酸序列也各异。Gaydos等报道用16SrRNA基因序列,设计出 21bp的引物 A和 B,扩增出466bp的片段产物。上述专家组也提出肺炎衣原体感染的理想诊断应是抗体滴度升高 4倍,伴有 PCR阳性。国内糜祖煌[6]报道运用套式 PCR采用 Campbell报道的二对引物 HL-1和HR-1内套引物得 378bp片段。李涛等[7]报道亦用套式 PCR根据 Campbell报道的特异性 Pst1酶限制性片段序列,通过计算机模拟,设计出二对引物 (内引物和外引物),并用丹麦 U-niversity of Aazhus赠送的 Cpn-DNA标准质粒为阳性对照。产物经序列测定查证测序图与肺炎衣原体 TW-183株,T-138株和 AR-39株,及主要外膜蛋白 (MOMP)基因序列比较,同源性达 96%以上。套式 PCR较之普通 PCR有了二次的扩增,产物更多,在 Agarose凝胶电泳上更敏感从而使某些假阴性样品可以出现阳性。

3.3 外周血单核细胞内肺炎衣原体抗原/包涵体检测法 1995年 Campbell[8]应用稀释 1:1000的 CF-2过氧化物酶染色法,生物素-抗生物素-过氧化物酶系统用属特异性的单克隆抗体检测肺炎衣原体脂多糖,证实在人冠状动脉组织里证明有肺炎衣原体抗原存在。Charlotte等[9]证明肺炎衣原体可以在人巨噬细胞、内皮细胞和主动脉平滑肌细胞生长、繁殖和复制。国内王卫群等[10]用直接免疫荧光法 (IF)检测动脉病理组织及外周血单核细胞中也存在肺炎衣原体抗原,腹主动脉瘤组肺炎衣原体抗原阳性率 83.0%,正常血管组 12.5%,动脉瘤组织中肺炎衣原体的特异性抗原有较高的检出率。

余竹元等[11]用吖啶橙代替 FITC标记单克隆抗体对肺炎衣原体 AR-39株感染的 HEp-2细胞株 72h后以单核细胞培养液进行吖啶橙染色,检测肺炎衣原体包涵体认为该法具有简捷价廉、反映包涵体核酸含量变化的优点。蔡俊明[12]等用冰冻保存一年以上的外周抗凝血低渗法制备淋巴细胞悬液直接免疫荧光法检测特异性肺炎衣原体包涵体。他们以肺炎衣原体TWL-029感染的 HEp-2细胞株,经 DIF染色后,在荧光显微镜下的细胞浆里,有被针对肺炎衣原体主要外膜蛋白(MOMP)的单克隆抗体结合,呈现荧光块状显示者,以光学镜及荧光显微镜判断确立绿色荧光位置在单核细胞里面,称为肺炎衣原体包涵体阳性;细胞核被 Evams Blue染色成红色者成为阴性,冠心病患者阳性率 20/150(13.3%)。

Haranaga等对 237名健康献血员的外周血5ml制备PBMC,用属特异性荧光标记单克隆抗体染色,观察到典型的苹果绿色的肺炎衣原体包涵体,阳性率 8.8%。王卫群等报道应用外周血淋巴细胞分离液离心法制备的 PBMC标本用改进的 DIF法,以特征性苹果绿色染色荧光颗粒数减去空白数后,多于4个亮点者为包涵体阳性。检测颈动脉硬化患者和正常人各 50例,阳性率分别是 62%和 30%。

3.4 细胞分离培养检测法 肺炎衣原体只能在细胞内生长的病原体,只能在活的细胞里培养、繁殖和复制。常用的细胞培养株有 McCoy、Hela-229和 HEp-2等。染色后在镜下观察到细胞内包涵体或以荧光标记单克隆抗体法检测。肺炎衣原体的组织培养和分离鉴定对肺炎衣原体感染的判断具有决定性意义。尿道和宫颈拭子标本的培养具有特异性 100%及敏感性80%。然而培养法繁琐、培养时间长、设备要求高、技术难度大,一般实验室难以具备。另外,若培养阴性时,它仍有阳性的可能,不能独立判断为阴性,仍需要其他种方法佐证才能最终判断为阴性。

3.5 胶体金检测法 拭子标本在经 NaOH消化,分裂细胞和释放抗原后,与抗肺炎衣原体单克隆抗体标记的胶体金颗粒结合,再滴加到吸附有抗肺炎衣原体属特异性脂多糖单抗的硝酸纤维素薄膜上。若待检拭子标本中有肺炎衣原体,则制成双抗体夹心免疫复合物,观察到一条红色细线。此法可检测宫颈、男性尿道、眼睑结膜、男性尿液等的肺炎衣原体,优点是特异、敏感、快速。

3.6 酶联免疫固相检测法 以酶标记的单克隆或多克隆抗体检测肺炎衣原体,酶反应后生成有色的产物。Mazzoli[13]报道用重组衣原体 LPS抗原宝贝微极,当加入人待检血液后,抗原-抗体结合,再加入过氧化物酶标记的抗人球蛋白,酶底物在 410nm的酶标仪下读数,可检出 IgM、IgG和 IgA抗体。Dako推出增强信号的酶联免疫放大系统,检测拭子里属特异肺炎衣原体。酶标记法简便快捷,适合大批标本的同时检测;缺点是某些细菌有交叉反应。酶联免疫固相法检测肺炎衣原体抗体以多少效价为标准很难确定。美国和加拿大疾控中心认为血清至少四周后有 4倍的抗体升高作为肺炎衣原体的感染较为合适[14]。

1 File TM,Bartlett JG,CassellGH,et al.The Importance of Chlamydia Pneumoniae as a pathogen:The 1996 consensus conference on Chlamydia Pneumoniae Infection[J].Infection Disease in Clinical Practice,1997,6:28-31.

2 Grayston JT,Kuo CC,Campbell LA,et al.Chlamydia Pneumoniae SP.Nova for Chlamydia SP.Strain TWAR[J].Int J Sys Bacteriol,1989,39(1):88-90.

3 Miyashita N,Fukawo H,Mouri K,et al.Seft-lim iting Pneumoniae Due to Chlamydia Pneumoniae[J].Internal Medicine,2005,44(8):870-874.

4 Miyashita N,Fukano H,Okimoton,et al.Clinical Presentation of Community-aquired Chlamydia Pneumoniae Pneumonia in adults[J].Chest,2002,121:1776-1781.

5 Boman J,Allrd A,Dersson K,et al.Rapid Diagnonsis of respiratory Chlamydia Pneumoniae infection by nested touchdown polymerase chain reaction compared with culture and antigen detection[J].Infect Dis,1997,175:1523-1526.

6 糜祖煌.肺炎衣原体的套式 (Nested)PCR检测及其临床意义[J].中国优生与遗传杂志,1997,5(2):14-16.

7 李涛,许香广,蔡俊明,等.肺炎衣原体感染与急性冠脉综合症的相关性 [J].中国误诊学杂志,2005,5(1):4-7.

8 Campbell LA,Ewand RO,Alison L,et al.Detection of Chlamydia Pneumoniae TWAR in human Coronary Altherectomy fissues[J].The journal of infections disease,1995,172:585-588.

9 Charlotte AG,James TS,Narendra NS,et al.Replication of Chlamydia Pneumoniae in Vitro in human Macrophages,Endothelial Cells,and Aortic Artery Smooth Musc le cells[J].Infection and Immunity,1996,64(5):1614-1620.

10 王卫群,张瑞华,龚辉,等.外周血单核细胞肺炎衣原体特异性抗原的检测 [J].中国临床医学,2001,8(2):136-138.

11 余竹元,项俊庆,王卫群,等.肺炎衣原体包涵体核酸组分衍化分析法的建立 [J].中国人兽共患病杂志,1999,15(5):9-11.

12 蔡俊明,许香广,张国良,等.冠心病患者肺炎衣原体包涵体的检测和意义 [J].海南医学院学报,2009,15(11):1456-1458.

13 Mazzoli S,Tofain N,Fantini A,et al.Chlamydia Pneumoniae Antibody responsein patientswith acute Myocardial infarctiom and their Follow-up[J].Am Heart J,1998,153(1):15-20.

14 Dowell SF,Peeling RW,Boman J,et al.Standardijing Chlamydia Pneumoniae assay:Recommendation from the Centers for Disease Control and Prevention(USA)and the Laberatory Centre for Disease Control(Canada)[J].Clin Infect Dis,2001,33:492-503.