微量生物DNA:能发挥重要作用的生物物证

郭显超,王 磊,谢 华

(1.深圳市司法鉴定专家委员会,广东深圳 518034;2.郑州市公安局刑侦支队河南郑州 450004)

微量生物DNA:能发挥重要作用的生物物证

郭显超1,王 磊2,谢 华2

(1.深圳市司法鉴定专家委员会,广东深圳 518034;2.郑州市公安局刑侦支队河南郑州 450004)

DNA技术在刑事案件侦破中发挥的作用愈显重要,一些常见的生物检材已经有了正确发现和提取的意识和方法。但是,微量生物检材还未引起现场勘查人员的普遍重视。如能对微量检材尽可能地成功提取和检验,DNA检验就能够在案件勘查中发挥更广泛的作用。

微量 DNA;PCR;LCN;生物物证

随着 DNA技术的普及,现场勘查人员对血斑、烟蒂、人体组织、毛发、精斑等常见检材已有了正确发现和提取的意识和方法。然而,微量生物检材还未引起现场勘查人员的普遍重视。微量 DNA,也称低拷贝模板 (low copy number,LCN)DNA,顾名思义是指量少的 DNA,常常低于 50pg,常规方法难以检测到理想的 DNA图谱,是法医 DNA检验的难点之一。微量生物检材涉及的检材面很广,理论上凡是与人体接触的部位都会留下人体细胞,如唾液斑:烟蒂、水杯、饮料瓶 (罐 )、牙刷、牙签、筷子、果核、口罩;存在脱落细胞的皮肤接触部位:衬衣、内裤、领带、帽子、手套、袜子、钥匙、挖耳勺、刀柄,汽车方向盘;人体排泄物:汗液、尿液。如能对上述微量检材尽可能地成功提取和检验,DNA检验就能够在案件勘查中发挥更广泛的作用。

1990年以后,PCR技术的出现,大大提高了法医DNA分析技术的灵敏度。特别是短串联重复序列 STR(short tandem repea)的发现,由于其具有易于扩增,对 DNA的质量要求低,故 PCR扩增成功率高,检测灵敏度高,重复性好,适用于微量、陈旧甚至腐败检材的 DNA分型鉴定。STR基因座分型方法简便、判型准确,分型程序明确、规范,所得分型结果图形简单,有利于实现 DNA分型标准化和自动化,有利于DNA分型数据的计算机存储、联网检索。因此 STR复合扩增技术已成为法医 DNA实验室对微量生物物证进行检验的主要手段。

利用 STR复合扩增技术,郑州市公安局的 DNA实验室每年都检验逾千起案件,直接破获和串并案件多起。处理低拷贝模板 DNA,应从以下四个方面做起:

一、微量生物物证的提取、保存和送检

现场生物物证的发现和提取是 DNA检验成功的重要步骤。只有得到足量的模板 DNA,才有可能发挥排除或认定的功效,而微量生物物证的成功提取是足量模板DNA提取的保障。

生物物证提取要注意两点:

1.防止污染:提取人员应注意戴口罩、鞋套、手套、头套,切忌直接触摸检材。

2.提取充分完全,尽可能多地收集目标细胞。提取时,对于小件物体,原物提取送检。若载体条件不允许,可用两步转移法[3],取 2-5根长约 0.5㎝的纱线或 0.3×0.3㎝的脱脂棉,用双蒸水浸湿后反复擦拭提取部位,再用同样大小的纱线或棉球反复擦干,均放入试管内送检。对于吸水性载体,需采取刮擦的方法提取。现场提取的方法还有:公安部物证鉴定中心研发的生物脱落细胞提取仪提取法,胶带粘附法。

二、微量 DNA的提取

DNA提取的常规方法有 Chelex-100法、硅珠法、有机试剂提取法。其中,Chelex-100法因其操作简便、成本低廉、DNA不易丢失和污染等优点得到广泛使用。但提取的 DNA杂质多、纯度不高、扩增效率不好,进行微量 DNA扩增时,往往需要对提取液进行纯化浓缩。有机试剂提取法得到的 DNA纯度较高,但需要生物检材量大,转移易丢失。硅珠法提取DNA灵敏度高、速度快,不受检材条件影响。此外,使用一些成熟的市售试剂盒也能得到满意的结果,如 Promega DNA IQ磁珠法和 Qiagen DNA Micro过滤柱法,此法 DNA纯度高,抑制物少,但需在多管转移,易发生污染和DNA丢失。

三、微量 DNA的扩增

对微量DNA的扩增可通过以下方法来提高检验的成功率:

1.增加循环次数,循环次数由 28增加至 32-34[4],以提高扩增产物的量。Gill等[5]使用 34个循环体系,扩增模板量为 0.025ng(相当于 4个细胞核DNA),得到了完全的 DNA图谱;

2.增加模板 DNA的量。用 Identifiler TM25μl体系扩增,加至 4.0-6.0μl,相应减少反应体系水的量,以保证扩增时模板DNA的所需;

3.减少 PCR反应体系。采用 5μl体系,可增加反应灵敏度,提高反应效率;

4.使用针对降解 DNA和微量DNA设计的min-Filer TM试剂盒;

5.对于扩增杂带多的情况,可以采用 Touch Down PCR[6]方法减少非特异带。

四、STR扩增产物的荧光检测

只要做好提取和扩增,使用现有的基因分析仪和检验技术,即可检测到微量 DNA,对效果不好的检材可以使用以下方法来提高检验效率。

1.在甲酰胺里增加扩增产物的量,提高 STR的量;

2.增大电泳仪进样电压和延长进样时间;

3.使用浓缩方法,增加样本浓度。

五、结果分析

对微量DNA进行分析,由于起始模板量少,结果会产生不对称扩增、等位基因的丢失 (drop out)或增加 (drop in)、影子带增强等问题,还有一些特异性带的出现,分析时应注意,并慎重判断。当得到较低的峰值时,应该重复实验,在结果中出现两次以上的等位基因时才能被采纳。

六、案例应用

案例 1:2007年 6月 28日,在郑州市一出租屋的床厢内发现一女尸,技术人员现场提取了一个快餐杯和两个饮料瓶,要求对检材上的唾液斑进行DNA检验。经检验,3个检材均得到了完整的 DNA图谱,峰高在 1000-2000rfus,峰形可信,成为认定嫌疑人的直接重要证据。

案例 2:2007年 5月 25日,郑州市某小区一老人在家中被害,经家属辨认,现场有一件衣服不是家庭成员所有。分局将衣服送检,要求检验衣服上的脱落细胞。后在衣服贴近皮肤处检出一完整的男性DNA图谱,峰高在 1000-2000rfus,峰形可信。犯罪嫌疑人被抓获后经DNA检验,与该衣服上的脱落细胞 DNA比中,成为诉讼的重要证据。

[1]Beckman Ls.et al.Survey of human and ratmic rosatellite.Genomics,1992,(12).

[2]裴黎.现代 DNA分析技术理论与方法 [M].北京:人民公安大学出版社,2002.

[3]严江伟,唐晖,王静等.DNA提取方法和 PCR循环次数对 STR扩增成功率的影响[J].中国法医学杂志,2005,151～153.

[4]Gill P,Whitaker J Flaxman C,et al.An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less 100pg of DNA.Forensic DNA International,2000,112∶17.

[5]Don R H,Cox P T,Wainwright B J,et al.“Touchdown”PCR to circumvent spurious priming during gene amplification,NuclAcids Res,1991,19(14).

DF794

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1008-2433(2010)04-0128-02

2010-05-08

郭显超 (1979—),男,河南邓州人,广东省深圳市司法鉴定专家委员会工作人员;王 磊 (1979—),男 ,河南潢川人,郑州市公安局刑侦支队民警;谢 华 (1977—),女,河南开封人,郑州市公安局刑侦支队民警。