一例遭清洗、雨淋的剪刀上做的DNA检验

赵 霖，付 永，何海军，李 花

（长沙市公安局刑侦支队，湖南 长沙 430003）

一例遭清洗、雨淋的剪刀上做的DNA检验

赵 霖，付 永，何海军，李 花

（长沙市公安局刑侦支队，湖南 长沙 430003）

公安机关在办理重大案件，特别是在办理具有难度的案件中，微量物证的DNA检验对整个案件的侦破能起到关键作用。微量物证具有肉眼无法识别、难发现、难提取、易污染、易破坏的特点，造成微量物证提取和检验的困难。“6.3”案件中对剪刀上微量物证的DNA检验是案件侦破中的一个很重要环节，对指导相关案件检验具有重要启示作用。

法医物证学；微量物证；DNA提取方法；QIAamp DNA Micro Kit

1.案件简介

2010年6月3日23时，长沙某小区发生一起夫妇在家中被杀死的重大杀人案，案发后展开现场勘查，在案发中心现场提取血迹41份送DNA实验室检验鉴定，案发后一直在下雨，两天后在勘查室外小区草丛中发现把柄为红色塑料式样的剪刀一把，无明显血迹，对其进行联苯胺血痕预实验为阳性。

2.材料与方法

2.1样本

外围现场剪刀一把，用滤纸擦拭后做联苯胺血痕预实验为阳性，决定进行下面实验。

2.2 DNA提取方法

在剪刀上用纱布分四段（两侧刀尖、两侧剪刀柄）提取，每处选取2块面积为2cm×2cm的纱布，用超纯水把其中一块纱布浸湿用力擦拭再用另一块纱布擦拭，擦拭后干湿两块都一起放入1.5ml的Eppendorf管中。加入Buffer ATL200ul、PK 20ul，震荡15秒，56℃3h，其间不时震荡，以达到充分消化的目的。取上述消化液200ul转移至另一Eppendorf管中，加入200ul的无水乙醇，震荡，放置5分钟使其达到室温状态（15℃-25℃）。加入200ul的AL Buffer及1ul溶解在AE液体中的转运RNA，震荡。离心，将上步的全部消化液小心地转移到QIAamp MinElute Columns中，离心8000rpm，1分钟。加入500ml的AW1液，注意不要将离心柱的内壁弄湿，离心8000rpm，1分钟。取出QIAamp MinElute Columns，放置在一个干净的2ml的收集管子中。在QIAamp MinElute Columns中加入500ml的AW2液，不要将离心柱的壁弄湿，离心13000rpm，3分钟。将QIAamp MinElute Columns取出，放置在一个干净的1.5ml的Eppendorf管中，在QIAamp MinElute Columns表膜的中央加入20-50ul的buffer AE，放置1分钟，使其处于室温（15℃——25℃），离心14000rpm，1分钟。以上离心均在高速冷冻离心机中进行，温度设定于20℃。

2.3 PCR扩增及扩增产物检验

用9700扩增仪和PowerPlex16试剂盒进行扩增，反应体系总体积为 10ul，模板 DNA 取 3ul，Gold STR 10×Buffer 1.0 ul，Primer Pair Mix 1.0 ul，Ampli Tag Gold 0.3 ul，不足部分以水补足，扩增产物在ABI3130XL分析仪中进行毛细管电泳分离，用GeneMapperID软件进行数据分析和等位基因分型。

3.结果及破案过程

右侧刀柄处获得男性死者与死者以外的另一男性混合基因型，左侧刀尖处获得两死者混合基因型，获得这个结果后进一步可以推断该剪刀为作案工具，并且这个剪刀可以作为两死者的致死工具，在后期的检验鉴定中发现现场6号血迹、现场洗手水池上提取的可疑血迹、洗手台上可疑血迹三处检测出除死者外的一男性基因型，经过比对后，分析认为男性死者基因型和六号血痕的基因型混合后可以得到剪刀刀柄处所得的死者跟死者以外另一男性混合的基因型，故可以推断“一人可以完成作案，嫌疑人有受伤的可能”两个观点；由于DNA检验结果的出现，再结合法医现场勘查、尸体损伤检验、痕迹勘查分析后技术一致认为“一人作案、剪刀为两死者共同的致死工具”；把这个结论反馈于侦查部门后，侦查部门在对案发时间段内小区现场视频录像中排查出一个符合作案的男性青年，对其排查后锁定该男性青年有重大嫌疑，案发7天后抓获该嫌疑人龙某，对龙某血痕进行DNA检测后同现场6号血迹、现场洗手水池上提取的可疑血迹、洗手台上可疑血迹比对发现15个STR基因座所有分型一致，能够达到同一认定的水平，在审讯的时候嫌疑人交代用剪刀作案后在洗手的水池里清洗过。DNA的检验结果为该案件的侦查破案提供了证据及方向发挥了重要作用。

4.讨论

DNA检验随着技术及方法的快速发展，理论上是支持单细胞扩增及检测，公安机关在办理重大案件，特别是在办理具有难度的案件中，微量物证的检验可以影响到整个案件的侦破，微量物证具有肉眼无法识别、难发现、难提取、易污染、易破坏的特点，该案件剪刀就差点被忽略。所以即使理论上支持单细胞扩增，但是在公安机关办案中是难以把握的，因为现场各种条件复杂，影响检材提取的不利因素多。该案件的难点在于剪刀虽然是作案的凶器，但是在作案后经历过嫌疑人的清洗，遗弃在草丛中经历过两天的雨淋，上面已经无明显血迹，检验条件差，并且该案件在勘查后，DNA检验结果未完成前法医在两个尸体上发现了不同类型的创口，在现场发现两种不同的足迹，杀死两人一个人难以同时完成，故在一人作案还是两人作案、一个凶器多种凶器这些问题上有争执；所以DNA检验对于案件侦破的发展来说就十分重要。下面就对该剪刀提取检验的难点及经验做个总结：

第一、DNA检验鉴定关键在提取。目前纯化方法多样及技术比较成熟，只有提取到DNA了才能保证能检验出来。该剪刀在提取检材时笔者认为首先要思考及规划提取方案，作为可疑凶器，结合剪刀的四个相对独立部分及四个部分都能被人体完成不同的活动或者前端两个刀尖可以实施在人体上完成不同活动的特点，故选择在四个独立的部分用二次提取法（干湿法）提取；在选择提取方案时要注意，在面对微量物证提取时要有意识能尽量多的提取到DNA，DNA检验对样品DNA浓度有阈值要求，所以在选择分段提取时不能认为分段分得越多就越好；分段提取的另一个职能是分段后尽量能提取到一个人的脱落细胞，所以要结合使用人完成该动作所需要的活动范围为最好；擦拭力度第一步湿提取要求力量稍大，能把遗留在物品上的粘附物擦拭到纱布上；第二步的干提取只是要求把第一步所遗留在物品上的水分吸干，最大可能地提取到脱落细胞。

第二、选择适合该物证的纯化方法。目前实验室纯化方法多样性，一般有磁珠法、纯化柱法。笔者认为从该案件的剪刀上提取的四个擦拭检材，DNA浓度含量不高，要避免在提取、纯化过程中有损失，所以才选择QIAamp的纯化柱。QIAamp DNA Micro试剂盒在有蛋白酶K和ATL缓冲液存在及高温的变性条件下，样品会发生裂解，在离液盐和乙醇存在的条件下，DNA选择性地结合至硅胶膜上，再通过洗涤去除蛋白、盐等其他杂质，最终，结合在硅胶膜上的DNA被洗脱下来。而此试剂盒中转运RNA（Carrier RNA）在纯化过程中减少了目标DNA的非特异性吸附，降低了提取过程中的损耗；QIAamp MinElute Columns尤其适合小体系洗脱液洗脱，从而达到浓缩目的。

第三、选择优良的扩增方法。微量物证DNA含量低，容易出现非特异性扩增，只有提高扩增体系中样品DNA的含量，尽量多加模板，少加水，适当提高点扩增体系中酶的含量，优化扩增体系。甚至模板含量不少的条件下可以分几个梯度扩增，增加1－2个扩增循环，但是绝对不能超过32个循环。

第四、对于混合基因型结果的判断及分析。混合基因型是一个复杂的分型，判断要相当的谨慎，思路要清晰。首先要明白只有单独混合基因型的存在是不能作为认定混合个体，必须要获得每个混合个体的基因型。混合基因型是多个基因座出现2个以上的等位基因，对混合基因型首先要排除生物学干扰因素，比如stutter峰及无效等位基因的存在，stutter峰一般峰高小于样品峰，其次要获得每个峰型的峰高，才能判断是否为混合基因型、混合比例。该剪刀上出现的多个基因型的位点笔者都先确定了干扰峰，对是相对高峰前一个并且小于相对高峰15%的都去除，每个基因座的等位基因最大数目都在四个以内，所以笔者初步判断为混合基因型；结合现场6号血迹、男性死者获得的基因型才能判断为该两人混合所得。

第五、检材处理过程中质量的控制。微量物证的DNA含量相对少，稍微一点外源性DNA就能污染样品，所以在对微量物证检验过程中最主要是一定要有防护措施，其次是要在进行每一步的过程中设阴性、阳性对照，在检测结果出现后要先查看每步阴性对照样品是否存在污染，再查看每步阳性对照样品是否准确，如果没有存在污染或者错误，那么微量物证样品才能作为一个准确的结果使用，如果对照样品存在污染或者错误的话可以查看是第几步对照样品出现问题，是可以溯源的。

5.总结

第一、DNA检测结果对案件现场、案件过程的重建有着关键作用。因为提检分离的原则，实验室人员一直忽视对现场的勘察，长期以检材为检验目标，导致了实验室人员缺乏对案件整体性的把握较差。该案件笔者单位领导组织DNA检验人员对现场进行勘查、指导分局提取现场检材，实验室人员在现场勘查后对案件现场有了整体的把握，回到实验室检验后对照自己的检验结果，分析作案过程，推测犯罪嫌疑人作案的心理活动，为案件重建发挥了重要作用。该案件中在现场的多处血迹里查出了混合基因型，而且除了两死者外只有另一男性的基因型，结合每个人的血迹分布后，重现了整个作案过程，技术上才一致认同为一人作案可以完成，最终确定了侦查方向，最后在视频侦查中锁定了犯罪嫌疑人。

第二、DNA结果对致伤工具的认定有着关键作用，能在可疑工具上检验出死者或者犯罪嫌疑人的基因型结合死者创口形态是完全可以认定致伤工具的，这个作用是其他检验办法无法完成的；该案件由于剪刀上有两死者及另一男性成分后法医再结合DNA结果对尸体创口形态分析，最终才形成统一的技术结论，为案件的侦破提供了准确的方向。

第三、刑事技术是一个统一的整体，各专业之间是要密切配合，所得出的结论要互相印证，出现矛盾的时候要寻找并分析原因，DNA技术的出现及发展是建立在刑事技术上面的，所以DNA技术的应用不能只停留在实验室的数据上。

Abstract:In the process of handling major cases by public security organs,especially in handling difficult cases,DNA testing on the material evidence of small quantity plays a key role in solving the overall case.With such characteristics as invisibility,difficulty of being found and extracted,process of being contaminated and damaged,material evidences of small quantity are not easy to be extracted and tested.Therefore,in the case of June 3rd,DNA testing on the scissors with material evidence of small quantity is an important part in the whole investigational work,and it is of important enlightenment for guiding relative cases.

Key words:forensic examination of material evidence;material evidence of small quantity；DNA extraction；QIAamp DNA Micro Kit

（责任编辑：王道春）

DNA Testing on the Washed and Rained Scissors

ZHAO Lin,FU Yong,Hehai Jun,Li Hua

（Changsha Public Security Bureau,Changsha,430003,Hunan）

D918

A

1008-7575(2010)06-0016-02

2010-10-22

赵霖（1984－ ），男，云南昆明人，长沙市公安局刑侦支队技术大队DNA实验室法医师，三级警司。