口蹄疫病毒非型特异性检测方法研究进展*

李 乐,苗海生

(云南省畜牧兽医科学院,云南昆明 650224)

口蹄疫病毒非型特异性检测方法研究进展*

李 乐,苗海生

(云南省畜牧兽医科学院,云南昆明 650224)

口蹄疫病毒非型特异性检测方法避免了口蹄疫不同血清型影响试验的敏感性,可快速简单的诊断口蹄疫病毒,判断免疫效果,检测感染历史等,如口蹄疫非型特异性RT-PCR、口蹄疫3ABC检测、VIA抗原AGID检测等,在口蹄疫防控中有广泛的应用。目前一些新开发的非型特异性检测方法更突出了简便性、快速性的特点,如横流装置(lateral flow device,LFD)可在1 min～10 min完验,设备只需要一台简单的样品搅拌器,非常适合基层使用。

口蹄疫病毒;非型特异性;非结构蛋白

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的主要侵害偶蹄类动物的A类动物疫病。常见的实验室检测方法有 RT-PCR、抗原捕获酶联免疫吸附试验(AC-ELISA)、液相阻断酶联免疫吸附试验(LPB-ELISA)、3ABC-ELISA检测、中和试验(VN)、正向血凝抑制试验、补体结合试验、琼脂扩散试验(AGID)等。口蹄疫有7个血清型,VN、AV-ELISA、LPB-ELISA等检测方法能够区别口蹄疫病毒的血清型,为型特异性口蹄疫诊断方法,而AGID、3ABC检测方法等检测方法不能区别口蹄疫血清型,为非型特异性口蹄疫诊断方法,口蹄疫病毒血清型特异性检测方法和非型特异性检测方法各有优缺点,型特异性检测方法可以检测出口蹄疫病毒血清型来,但是很多情况需要使用非型特异性检测,如边境动物流动控制中,只需要1次非型特异性检测检测就可以得出是否口蹄疫感染的结论,如果一个动物进行7次口蹄疫检测,就会消耗大量的人力物力。进行口蹄疫免疫状况调查也需要非特异性检测方法,一次试验可检测出疫苗的免疫效果,不必要进行多次的试验。常见的口蹄疫病毒非特异型检测方法有口蹄疫非型特异性 RT-PCR、口蹄疫3ABC检测、VIA抗原AGID检测等,目前开发的很多口蹄疫病毒非结构蛋白(NSPs)检测方法都为非型特异性检测方法。

1 非型特异性RT-PCR检测方法

RT-PCR是一种快速方便的口蹄疫病毒检测方法,非型特异性RT-PCR,用于普查动物否隐性带有口蹄疫病毒,如果检测到阳性,可再进行病毒分离和定型等一系列试验。国内早在1998年朱彩珠等[1]报告非型的特异性RT-PCR检测方法,检测序列相应于FMDV结构蛋白VP1基因后2/3区段,在4个血清型之间基本一致。目前开发的口蹄疫PCR方法多为实时荧光定量RT-PCR(real-time RTPCR),比传统PCR有更高的敏感性,针对非型特异性的核酸片段,使real-time RT-PCR能够更加方便的用于动物流动控制,世界参考实验室(WRL)研究的一步法real-time RT-PCR[2],通过257份样品的检测,证明有诊断价值,比传统的二步法real-time RT-PCR更方便稳定,花群义等[3]针对口蹄疫非型特异性的聚合酶3D基因序列,设计合成了引物和探针,可检测到相当于9.1TCID50的病毒RNA,敏感性非常高。设计合理的口蹄疫非型特异性RT-PCR可以从混合感染病料中检测出口蹄疫病毒,Fernández J等[4]开发优化的多元 RT-PCR(multiplex RT-PCR),可从猪水疱性口炎(Swine vesicular disease,SVD)、水疱性口炎(Vesicular stomatitis)病料中一步检测出口蹄疫病毒核酸,有良好的应用前景。

2 口蹄疫病毒NSPs检测方法

大部分口蹄疫病毒非结构蛋白为保守蛋白,不具有型特异性,依据非结构蛋白开发的诊断方法可无区别的用于7个血清型的检测,即据此方法可检测出携带任何血清型口蹄疫病毒的动物,而不区分出其携带的是哪种血清型。常见的非结构蛋白检测方法有3ABC、3AB、3D等,口蹄疫疫苗免疫的动物很少有3ABC、3AB抗体,因此3ABC和3AB检测方法常用于检测动物是否感染口蹄疫病病毒,由于具有非型特异性,3ABC和3AB试剂盒可方便的用于大批量的动物普查,找到隐性感染口蹄疫病毒的动物。有关3ABC和3AB检测方法有大量的研究报告[5-8],市场上也已有3ABC和3AB检测试剂盒上市。3ABC和3AB检测方法不能用于免疫动物的血清抗体水平评价,免疫动物的抗体评价需要使用传统的型特异性口蹄疫病毒LPB-ELISA和微量细胞中和试验的方法精确检测抗体滴度,但由于型特异性的特点和条件上的限制不适用于大批量的田间抗体普查。

3D蛋白是感染性相关抗原(virus-infection-associated antigen,VIAA)的主要组成部分,为 RNA聚合酶,在疫苗中含量比较高,疫苗免疫动物会产生VIAA抗体,因此用3D蛋白开发的方法一般不用于区别免疫和感染。3D蛋白非常保守,不同血清型和血清亚型的3D核酸系列和蛋白构像基本不变[9-10],使得3D蛋白成为开发非型特异性口蹄疫检测方法的理想目标。3D蛋白可用于大批量评价的动物血清抗体水平普查,可确定动物是否接触过口蹄疫抗原,并可对疫苗的免疫效果进行评价。早在1970年McVicar J W等[11]就建立了VIAA抗原检测琼脂扩散试验(AGID),该方法用组织培养的病毒培养液提取半纯化的VIA抗原(semi-purified)来进行试验,该方法的缺点是敏感性不高,优点是便宜,容易操作,AGID作为一种标准的口蹄疫病毒非型特异性检测方法用于世界各地,在我国也作为一种标准检测方法而广泛应用于边境动物检测。AGID目前正被以重组技术为基础的非结构蛋白检测方法取代。

起初通过表达VIAA建立的检测方法可用于评价动物是否接触过口蹄疫病毒抗原,但该方法的敏感性还是不够,无法用于要求精确的试验[12]。世界口蹄疫参考实验室(WRL)将3D和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合表达后,通过提取高纯度的3D蛋白建立的简单间接ELISA可无区别的检测出7个血清型口蹄疫病毒抗体,敏感性稍微低于LPB-ELISA[13],检测口蹄疫病毒的特异性为95%,但是试验也证明了3D蛋白和其他肠道病毒的聚合酶有相同的抗原表位,使诊断产生有一定的误差。

3 以单抗为基础的非型特异性口蹄疫病毒检测方法

合适的的单克隆抗体可以提高检测的敏感性、准确性。Brocchi E等[14]通过单抗建立了型特异性的口蹄疫检测方法,该方法敏感性特异性高,成为伦巴第及艾米利亚-罗马涅大区的动物疾病预防实验室(Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna,IZSLER)常规口蹄疫检测方法。挑选针对非型特异性抗原位点的单抗,能建立非型特异性口蹄疫检测方法,Smitsaart E N等[15]报告了针对口蹄疫12 S抗原挑选的单克隆抗体,能够检测出7个口蹄疫血清型中的6个,但未见以此单抗建立检测试剂盒的后续报告。Yang M等[16]通过对口蹄疫3D蛋白的肽库的分析,选择挑选了Mabs位点来建立非型特异性ELISA,他们共合成了92个肽段,通过15头感染康复牛的血清来进行间接ELISA,发现其中一个肽段能识别15头牛中的12头,该肽段由3D蛋白中的16～30氨基酸构成,通过该肽段获得Mabs进行cELISA试验,研究表明牛羊经过人工感染后9 d可检测出阳性,试验证明用该单克隆抗体可开发新诊断方法。

横流装置(lateral flow device,LFD)是WRL最新开发的一种快速FMDV非特异性检测方法[17],该方法的基础是一个挑选出来的单克隆抗体,该抗体能够与口蹄疫病毒血清型毒株泛反应(pan-reactive),也就是具有非型特异性特征。用LFD方法对304份阳性血清和1 003份阴性血清进行检测,结果表明 LFD试验的敏感性和特异性比抗原捕获ELISA(AC-ELISA)稍低,LFD敏感性为84%,特异性为99%,AC-ELISA的敏感性为85%,特异性为99.9%,但是LFD比AC-ELISA更为快速的方便,整个试验1 min～10 min完成,简单的样品搅拌器可以完成样品处理,非常适合田间试验。LFD目前有试剂盒销售。

4 展望

口蹄疫病毒非型特异性检测方法突出的优点为简单、快速、适合基层应用,LFD横流装置在1 min～10 min完成试验,具有一定敏感性,是理想的口蹄疫病毒检测方法,但LFD是抗原检测方法,口蹄疫临床症状比较明显,抗原检测方法意义没有抗体检测意义大,抗体检测可以用于免疫效果检测、感染历史检测等,如果能够建立快速简单、适合基层应用的口蹄疫非型特异性血清抗体检测方法,如在方便简单方面达到LFD横流装置的指标,将有重要的应用价值。

[1]朱彩珠,卢永干.应用反转录-聚合酶链反应检测口蹄疫病毒[J].病毒学报,1998,14(3):272-278

[2]Shaw A E,Reid S M,Ebert K,et al.Implementation of a onestep real-time RT-PCR protocol for diagnosis of foot-andmouth disease[J].J Virol Meth,2007,143(1):81-85

[3]花群义,金宁一,周晓黎,等.应用实时荧光定量TaqMan RTPCR检测口蹄疫病毒[J].中国兽医学报,2005,13(4):116-119.

[4]Fernándeza J,Agüeroa M,Romeroa L,et,al.Rapid and differential diagnosis of foot-and-mouth disease,swine vesicular disease,and vesicular stomatitis by a new multiplex RT-PCR assay[J].J Virol Meth,2008,147(2):301-311.

[5]Robiolo B,Seki C,Fondevilla N,et al.Analy sis of the immune response to FMDV structural and non-structural proteins in cattle in Argentina by the combined use of liquid phase and 3ABC-ELISA tests[J].Vaccine,2006,24(7):997-1008.

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[9]M anju G,Ramamurthy V,Bramhadev P,et al.Sequence analysis of the RNA polymerase gene of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1[J].Virus Gen,2001,22:21-26.

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[16]Yang M,Clavijo A,Li M Y,et al.Identification of a major antibody binding epitope in the non-structural protein 3D of footand-mouth disease virus in cattle and the development of a monoclonal antibody with diagnostic applications[J].J Immunol Meth,2007,321:174-181.

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Progress on Non-type-specific Detection Method for FMDV

LI Le,MIAO Hai-sheng

(Y unnan Animal Husbandry and Veterinary Science Institute,K unming,Y unnan,650224,China)

Non-type-specific detection methods can not distinguish serotypes of FMDV antigen,but can quickly and accurately determine the animal carriers,and the immunological conditions,so play important role in FMD control strategy.Non-type-specific FMDV detection methods include RT-PCR,FMDV 3ABC test,VIA antigen AGID test and so on.At the present,many new non-type-specific detection methods underline its simpleness and rapidness.Such as lateral flow device(LFD),can give result in 1-10 minute,so can be easily used in fields.

Foot-and-mouth diseases virus;non-typespecificity;non-structural protein

S852.659.6

A

1007-5038(2010)03-0079-03

2009-09-30

云南省社会发展科技计划项目(2007C255M);云南省农业科技创新工程项目(2008LA019)

李 乐(1969-),男,云南昆明人,副研究员,主要从事动物病毒学研究。