生物荧光标记物的新型材料——过渡金属离子掺杂的 ZnS、ZnSe量子点

欧红叶

(重庆师范大学学报(自然科学版)编辑部,重庆 沙坪坝 400047)

量子点即半导体纳米晶,自1998年以来被广泛地应用于生物标记[1].量子点具有高量子效率、高消光系数、激发光谱宽且连续、对称且窄的发射光谱、发射光的颜色随粒径变化、光化学稳定性好等特点,可用于多种标记物的同时检测,与传统的同位素和荧光染料相比具有不可比拟的优势[2].随着研究的逐步深入,作为生物标记物的量子点,成为分析科学中一个新兴的、前沿的、最为活跃的研究领域.在过去的 10年中,关于量子点的制取及其作为荧光标记物在生物领域的应用都进行了大量的研究.如 CdE(E=S,Se,Te),尤其 CdSe量子点及其核壳结构是生物标记研究中最活跃的发光材料,但是含镉重金属离子的量子点所具有的毒性使其在未来的生物、医学、药学等应用中存在着隐患,因此,开发新的无镉量子点作为基质材料用于生物荧光标识是解决以上问题的关键.过渡离子掺杂的 ZnS、ZnSe量子点在基质选择上迎合了绿色环保的要求,同时基质半导体材料的带隙与掺杂的过渡离子激发态的能级具有较大的差异,所以获得能量低于基质体材料带边(ZnSe:470 nm,ZnS:337 nm)的发光 (如蓝、绿、黄、橘红色)是完全可能的.而且由于过渡离子掺杂的量子点的发光机制与量子点本身的发光机制不同,它所产生的大斯托克斯平移能够阻止由于 Forster能量传递或再吸收所引起的量子点发光的自猝灭.所以,过渡离子掺杂 ZnS、ZnSe量子点的优越性迎合了当前用于生物标记发光材料的需求,相信将会在未来的生物医学领域大有作为.

1 量子点作为荧光生物标记物的优越性以及研究进展

目前有 4类材料可用作生物标记:1)具有光学活性的金属纳米粒子;2)有机荧光材料;3)发光量子点;4)纳米复合材料.纳米金属离子一般不稳定,表面活性使它们很容易团聚,虽然加入反絮凝剂或表面活性剂可以避免这种团聚,但它的使用仍受到一定的限制;有机荧光材料发光谱较窄、荧光特征谱较宽,很难同时激发多种组分和区分不同探针分子的荧光,不易同时检测多种组分,而且其光化学稳定性差,易光漂白与光解,发出荧光光子平均数量少,光解产物会对生物体产生杀伤作用;量子点能多色标记,发光强度高,光化学稳定性好,周期长,可持续几小时,但是由于量子点大比表面积使得其有很多的表面态,降低了量子点的发光效率;核壳结构[3]的纳米晶体复合粒子结构能有效限制对核的激发,防止由于量子点的高表面区所带来的低发光效率,对光化学降解也有一定的抑制作用.因此具有核壳结构的纳米复合粒子是目前生物标定的主流.因此,在过去的 10年中,关于量子点的制取及其作为荧光标记物在生物领域的应用都进行了大量的研究,尤其 CdSe量子点及其核壳结构是生物标记研究中最活跃的发光材料.

在量子制取方面,1996年,Hines等人合成了 ZnS包覆的 CdSe量子点,其在室温下的荧光产率比未被包覆的 CdSe量子点相比获得显著提高.Dabbousi等人[3]在此基础上,将其制备好的单分散的 CdSe纳米颗粒表面包覆了一层 ZnS,将其量子产率提高到 30%～50%.近来,Peng等人[4]对传统的合成方法进行了改进,他们用 CdO作为原料,一步合成了高荧光产率的 CdS、CdSe、CdTe纳米晶体.相对于传统的核/壳纳米微粒,该方法合成的量子点在不进行表面包覆的情况下也具有非常高的量子产率,而且为量子点的合成提供了一条绿色的通道,所以是目前在有机体系中能够合成的单分散较好、光化学性质稳定、量子效率较高的量子点,这为量子点在生物标识中的应用打下坚实的基础.同时,关于它的最终应用,量子点标记技术在动物体内的研究也在最近 10年取得了相当大的进展.1998年,Alivisatos和 Nie两个研究小组分别将量子点作为生物探针,并且应用于活细胞体系,他们解决了如何将量子点溶于水溶液,以及量子点如何通过表面的活性基团与生物大分子偶联的问题.Alivisatos等人[1]报道是通过静电引力、氢键作用或特异的配体 -受体相互作用将生物分子结合在量子点的表面.他们采用两种大小不同的量子点标记3T3小鼠的成纤维细胞,一种发射绿色荧光,一种发射红色荧光,并且将发射红色荧光的量子点特异地标记在F2肌动蛋白丝上,而发射绿光的量子点与尿素和乙酸结合,这样的量子点与细胞核具有高亲和力,并且可以同时在细胞中观察到红色和绿色的荧光.Nie等人[2]则通过巯基乙酸中的巯基与量子点表面的 Zn原子结合,游离的羧基一方面使量子点具有可溶性,另一方面可与不同的生物分子(例如蛋白质、多肽、核酸等)共价结合.他们将转铁蛋白与量子点共价交联,在受体介导下发生内吞作用,即可将量子点转运进 HeLa细胞中,说明连接了量子点的转铁蛋白仍然具有生物活性.这两个研究小组的研究成果掀起了量子点在生物医学上应用的高潮.

在此基础上,科学家们掀起了进一步把量子点用于动物的活体的研究.2002年,Akerman等人[4]用可减少网状内皮系统非特异性吞噬的PEG(聚乙二醇)包裹 CdSe/ZnS量子点后,将上述量子点经尾静脉注射,特异性地标记了裸鼠的肺血管和 MDA-MB-435人乳腺癌异种移植肿瘤血管,实现了量子点在动物活体中的标记.2003年,Larson将水溶性的 CdSe/ZnS量子点经尾静脉注射给小鼠,通过双光子扫描显微镜观察到皮下毛细血管高清晰度的三维影像及每分钟640次的毛细血管搏动,这是继 Akerman等人在小鼠体内用量子点标记肺血管及肿瘤血管后的又一次动物体内量子点荧光显像[1].这种高分辨率和高信噪比的量子点标记图像用多光子显微镜观察,论文发表后曾引起巨大震动.由于量子点荧光显像这一新技术目前仅在体外或小动物(鼠)体内进行,而且需采用双光子扫描显微镜来观察,仅能观察到皮下几百微米的亚细胞分辨率的影像,对于大动物(狗、猪等)及其体内深器官尚无法观察.但是,Kim等人[5]在2004年将CdSe量子点注射到鼠的前肢皮下和猪的腹股沟皮下,观察到量子点可被引流到前哨淋巴结,依靠卤素光源激发 CdSe量子点发出的近红外线,用 CCD相机获取信号,使前哨淋巴结显像.这为大动物显像及在临床手术中准确切除肿瘤和受侵犯淋巴结提供了新方法[6],也为病理诊断提供了依据.虽然量子点目前尚未用于病理组织切片中,但其在细胞及活体中的应用为以后将量子点用于病理诊断奠定了基础.

以上的研究结果说明,随着制备技术的不断提高,量子点必将成为最有潜力的荧光标记材料,尤其在活细胞和活体动物标记上.CdE量子点已经能够应用于生物标记,而且是一种比较好的生物标记材料.但是 CdE量子点含有有毒的重金属离子镉,它对活体细胞可能产生的毒副作用受到了越来越多的研究人员的关心.2003年,Derfus等人[7]在体外将 TOPO包裹的 CdSe量子点与肝细胞共同培养,发现 CdSe量子点对肝细胞有一定的毒性作用,抑制了它们的活性,同时研究人员也证实量子点的毒性同其代谢过程中释放的 Cd有密切关系.Kirchner等人[8]研究了CdSe/ZnS核壳结构量子点对细胞的毒性作用,同样发现量子点释放到外环境中的 Cd可以对细胞产生毒性作用.2005年,Lovric等人发现 CdTe量子点可以引起细胞染色质凝聚和细胞膜空泡变,从而导致细胞死亡,浓度达到 10 g/L时即可对细胞产生明显的毒性作用,试验中还发现小的发绿色荧光带有正电荷的量子点比体积较大的发红色荧光电中性的量子点具有更加显著的细胞毒作用.综上所述,我们认为 CdE量子点通过其释放到环境中的重金属离子会对细胞产生一定的毒副作用,从而抑制细胞的生长.因此,开发新的无镉量子点作为基质材料用于生物荧光标识是必然的发展方向.

2 过渡离子掺杂的 ZnS、ZnSe量子点相的本质优越性及研究进展

过渡离子(Mn、Cu)掺杂的 ZnS、ZnSe量子点首先从基质材料的选择方面迎合了绿色环保的需求,除了它的低毒性,掺杂量子点还能克服非掺杂量子点的很多本质缺点.比如:掺杂的量子点的发光机制与量子点本身的发光机制不同,它所产生的大斯托克斯平移能够阻止在非掺杂量子点中由于 Forster能量传递或再吸收所引起的量子点发光的自猝灭;掺杂量子点具有更好的热稳定性和光化学稳定性.同时,从发射光的能量看,量子点基质半导体材料的带隙与掺杂的过渡离子激发态的能级具有较大的差异,再加上量子点的发光能量随着粒径的大小而变化,所以,以ZnSe(带边 :470 nm)、ZnS(带边 :337 nm)为基质材料获得低于带边的一系列的发光(如蓝、绿、黄、橘红色)是完全可能的.因此,制备高效的、稳定的过渡金属掺杂量子点一直是研究者努力的方向.早在1994年,Bhargava等人[9]就首次报道了锰掺杂的 ZnS纳米超微粒,发现过渡离子Mn2+的掺杂使得发光效率得到有效提高,并且他们的实验结果预示着掺杂量子点将是一种新型的高效的发光材料.然而将过渡离子掺杂的量子点应用于生物标识是近两年才涌现出来的新想法.Peng等人[10]在2005,2006和 2007年连续报道了在有机相中用高温分解方法首次提出用晶体成核与生长退耦合技术合成的制备 Cu:ZnSe和 Mn:ZnSe量子点.一般情况下,高温分解的方法所制备的量子点尺寸较小且比较均匀,而且通过控制反应温度来控制晶体生长增加了实验的可操作性,为一次性制备不同粒径的量子点并且有效地控制过渡离子的掺杂创造了良好的条件.但是传统的合成掺杂量子点的方法是将掺杂材料与基质材料同时加入到反应器中在同一温度下进行反应,这往往会导致掺杂不均匀或根本没有掺杂进去的情况,使得制备出的掺杂量子点质量不高.Peng等人提出的利用晶体成核与生长退耦合技术,解决了传统合成量子点方法的局限性并制备出了高效、稳定的适合于生物荧光标记的量子点.他们的制备方式具体的分为晶核掺杂和生长掺杂.在生长 ZnSe:Mn时,既可选择晶核掺杂也可选择生长掺杂,但是从实验结果来看,用晶核掺杂生长的量子点效率明显高于用生长掺杂的量子点.他们所合成的 Mn:ZnSe量子点具有尺寸小(7～8 nm),稳定性好(空气中紫外光连续照射稳定存放 25 d以上),量子产率高(约为 40%)等特点.但是,在量子点用于生物标记之前,在水性生物条件下必须具有 3种特性:有效的荧光性、胶质稳定性、低的非特异性吸.用于生物标记的量子点,在有机体系中合成量子点表面是疏水的,然而用作荧光标记的量子点必须是水溶性的,因此在与生物分子偶联之前,必须先将其表面用一定的双功能基团修饰,使其具备一定的水溶性同时又能与生物分子偶联.目前,主要有以下几种途径解决量子点水溶性的问题:

1)利用其表面负电荷和带有正电荷的生物分子通过静电吸附作用进行连接,完成荧光量子点从疏水到亲水的相转变,从而实现对生物分子的标记.如二氢硫辛酸[11].

2)通过表面配体交换.主要是利用 Zn、Cd等原子与 S原子之间有效的键合作用,巯基化合物取代量子点表面原有的有机配体,使其从疏水性转变为亲水性,然后借助另一端的功能团与生物分子进行耦联.如巯基化合物、带有巯基的二硫苏糖醇(DTT)和 2,3-二巯基顺丁烯二酸作为交换配体[12].

3)通过硅烷化处理对量子点表面进行修饰.在量子点外包覆一层硅烷化试剂,以此来增加量子点的水溶性,其荧光性质和稳定性比较理想,并且通过外层硅烷化试剂的末端所带不同的官能团 (—NH2、—SH、—COOH等),可以与不同的生物分子进行连接,从而实现对生物分子的标记[13].

4)通过亲疏水相互作用实现相转移.通过亲疏水相互作用在其表面的单层配体外形成双层或多层配体,将量子点直接包埋入聚合物球的空腔或形成的疏水腔中,如 PEG-PE(聚合磷脂酰乙醇胺)等[14].

由于掺杂量子点表面的 Zn与 S具有有效的键合作用,从而通过表面配体交换来获取水溶性的量子点是完全可行的.因此,他们选择第二种方式用所合成的量子点表面经 MPA水溶性修饰后,做了初步探测性实验.他们用链接了抗生素蛋白的 Mn:ZnSe量子点很好地识别了涂在玻璃载波片的 “UA”形的生物素样本,预示着过渡离子掺杂的量子点在生物标记领域中具有巨大的研究及应用潜能.并且他们用所合成的量子点表面经 MPA水溶性修饰后,做了初步探测性实验.另外,他们用链接了抗生素蛋白的 Mn:ZnSe量子点很好地识别了涂在玻璃载波片的 “UA”形的生物素样本,预示着过渡离子掺杂的量子点在生物标记领域中具有巨大的研究及应用潜能.

3 结语

量子点最有前途的应用领域是在生物体系中作为荧光探针.目前研究最多的 CdSe量子点在荧光标记方面具有独特的优势,但是镉(Cd)元素对机体存在潜在毒性,虽然在某些生物应用中,如显像所用材料[5]含 Cd剂量比其毒性剂量大大减小,然而对机体是否有长期毒性仍有待研究.过渡离子(Mn、Cu)掺杂的 ZnSe、ZnS量子点从基质材料的选择方面迎合了绿色环保的需求,然而,它在生物标识方面的研究仍处在初期,获得稳定、高效、水溶性较好的量子点,并且适当选择配体解决其生物偶联等问题对进行荧光标记的研究具有重大的意义.

基质半导体材料(ZnSe)的带隙与掺杂的过渡离子激发态的能级具有较大的差异,所以获得能量低于基质体材料带边(ZnSe:470 nm)的发光(如绿、黄、橘红色)是完全可能的.而且由于过渡离子掺杂[15-16]的量子点的发光机制与量子点本身的发光机制不同,它所产生的大斯托克斯平移能够阻止由于 Forster能量传递或再吸收所引起的量子点发光的自猝灭,这对生物芯片及基因组学和蛋白质组学的研究十分有用.

过渡离子掺杂的量子点完全可以避免由于重金属离子给生物体带来的潜在危害,合成稳定的、高效的、水溶性的掺杂量子点迎合了当前用于生物标记发光材料的需求.相信将会在未来的生物医学领域大有作为.

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