蛋白质组学研究的有效工具——双向电泳鉴定技术

张 颖,杨 舸

(1.攀枝花学院 生物与化学工程学院,四川 攀枝花 617000;2.攀枝花学院 生物与化工研究所,四川 攀枝花 617000;3.攀枝花市食品与药品监督管理局,四川 攀枝花 617000)

1 双向电泳的原理和方法

双向电泳技术是根据蛋白质等电点和分子量两个相互独立的参数,在相互垂直的两个方向进行二次电泳的过程.首先在第一向电泳中根据蛋白质所带电荷的性质进行等点聚焦(IEF),等点聚焦时由于各种蛋白等电点的不同,在高电压场的作用下,蛋白质在pH梯度胶中移动,直到取得不同的位置;然后再根据蛋白分子量的不同,在SDS-烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)中进行第二次分离.

第一向等点聚焦有 3种常见的方法:非固相的 ISO-DALT、固相的 IPG-DALT和非平衡的NEPhGE.其中 NEPhGE主要用于分离碱性蛋白质.目前 IPG-DALT已经取代其他两者成为等点聚焦的主要手段.它的优势在于[1]:pH梯度稳定,聚焦准确,精度高;无阴极漂移及碱性蛋白丢失的现象;蛋白上样量大,可以提高低丰度成分的分辨效果;样品中盐的干扰少,无边缘效应;pH梯度和分离结果的重复性好.第二向 SDSPAGE电泳只有垂直和水平两种形式,水平电泳可防止凝胶在染色过程中变形,因为凝胶厚度减小(可至0.5mm),获得的蛋白点的分辨率较高,而且可以应用较高电压,缩短了电泳时间从而减少蛋白扩散[2];垂直电泳则可同时跑多块胶,有利于应用计算机割点并进行平行差异分析,大大提高效率.现在国内大多数实验室所用的都是垂直的第二向电泳.

2 双向电泳的主要技术步骤

2.1 样品制备

样品制备是双向电泳的关键,主要包括蛋白溶解、变性、还原等步骤,去除盐离子、色素、酚类和核酸等非蛋白物质,以保证顺利电泳.样本预处理的重点在于提高难溶蛋白的溶解度以及去除看家基因的表达产物对低丰度蛋白的掩盖作用.现在已有提取不同组份蛋白的试剂盒,提高了样品处理效率和重复性,但蛋白质的种类及特性千差万别,所以要想用一种“标准”的样本溶液成分同时溶解并提取所有不同来源的样本的蛋白几乎是不可能的.根据实验要求的不同,可按各种属性将蛋白分别提取,比如 Molloy等[3]用3种分别适合溶解高、中、低亲水性蛋白质的裂解液分步提取大肠杆菌蛋白质.对于低丰度蛋白的提取,可在样本中加入蛋白酶抑制剂以防蛋白质水解,在样本处理中尽量富集低丰度蛋白,并采用灵敏度较高的银染或荧光染色.

2.2 电泳(IEF/SDS-PAGE)

电泳包括 IEF、IPG胶条的平衡和 SDS-PAGE三个主要步骤.为了保证良好的电泳重复性,目前一般实验室 IEF通常都使用商业化的预制 IPG干胶条,可以根据实验目的选择使用连续性或非连续性 pH梯度胶条、宽 pH梯度或窄 pH梯度胶条.平衡的作用在于充分打开蛋白结构中的二硫键,进行蛋白的烷基化,修饰蛋白的自由巯基,阻止断开的二硫键重新形成,以便进行下面的 SDS-PAGE.第二向 SDS-PAGE可根据实验要求采用水平和垂直两种方式,水平胶厚度小,分辨率高,而垂直电泳体系效率高,可用于大规模蛋白质组分析.

2.3 凝胶的染色

PAGE凝胶的染色方法有很多种,主要包括有机染料染色如溴酚蓝染色、氨基黑染色和考马斯亮蓝染色等,银染,负染,胶体扩散染料染色,胶体金属染料染色,荧光染色,金属螯合染料染色,放射自显影等多种方法.目前常用的染色方法有考马斯亮蓝染色、银染以及荧光染色等[4].考马斯亮蓝染色是经典方法,但灵敏度较低.银染灵敏度要高得多,但是重复性难以控制,而且对质谱检测有干扰.荧光染色灵敏度高而且不需要染色后固定脱色等处理步骤,可以减少蛋白特别是低分子量蛋白丢失[5],缺点在于成本太高,而且只有含赖氨酸残基的蛋白才能被荧光染料标记.

2.4 图像分析

染色后得到的双向电泳凝胶图谱上有大小、明暗度和位置等各不相同的蛋白斑点,接下来的工作就是利用计算机辅助图像软件进行定量分析并获取大量有关这些蛋白斑点等电点和分子量的信息,具体操作[6]包括:数据的获取,用图像扫描仪、荧光测定仪等采集凝胶图像;图像加工,进行背景和污点的校正,滤掉一部分背景及去除部分水平和垂直条纹;斑点检测和定量,把凝胶上的蛋白点数字化,得到斑点面积、每点相对黑度等参数,可根据蛋白点面积的大小和颜色的深浅进行定量分析;凝胶配比,消除使图像变形的参数,将其转变成可比较的图像,随后进行配比,以得到理想的凝胶图谱,便于分析蛋白的变化;数据分析,分析凝胶中有效蛋白斑点数目、强度饱和的斑点数目和配比的斑点数目;数据呈递,计算每个被检测的蛋白斑点 Mr(分子量)/Ip(等电点)值;建立 2-DE数据库,用前面分析的许多诸如蛋白名称、Mr/Ip和目录性信息以及其它文献的描述性信息构建数据库[7].

3 双向电泳的技术特点及存在问题

3.1 分辨率

一般的双向电泳能分辨 1 000～3 000个点,是目前分析组份复杂蛋白分辨率最高的工具[8].双向电泳的分离能力取决于双向上的长度,通常认为与有效的分离面积成正比[9],对于特别复杂的样品,要获得最大分辨率,用特大胶可以从全细胞裂解液中分离得到 5 000～10 000个蛋白点[10].IPG干胶条,水平电泳,在有效范围内增大凝胶面积等措施都有助于提高分辨率.如利用多块重叠范围放大 IPG胶来生成复杂样本的 2-DE蛋白图谱[11]更具有明显优势.但细胞内含有大约 3～5万种蛋白质,所以现有的分辨率还远远不能满足分析细胞全蛋白的需要,特别是对细胞内的低丰度蛋白、极端酸性和碱性蛋白、分子量过大或过小蛋白、难溶蛋白等的电泳分离仍面临很大困难.

3.2 重复性

双向电泳的重复性一直是限制 2-DE被进一步广泛应用的瓶颈所在,它关系到不同实验室之间数据交换和利用,也直接影响蛋白质组研究的价值和应用[12].以 IPG胶代替传统的基于两性电解质的等点聚焦,较大程度上提高了双向电泳的重复性,但并非彻底解决.此外还可以通过省去浓缩胶,在第二向电泳中使用连续的分离胶等一些简化步骤的手段以减少操作误差,当然如果能将整个电泳过程实现自动化就能彻底消除操作误差.

3.3 双向电泳图谱的信息化

将双向电泳所得到的大量蛋白质组图谱用来建立蛋白质组图谱数据库,即对数字化蛋白点的分布部位、斑点面积和灰阶、背景过滤、2-DE凝胶配比,建立参考图谱.研究者可根据自己的需要对数据库进行检索,找到对应的参考图谱进行比对分析,只要是在极为标准的操作步骤下得到的凝胶图谱,就可以根据蛋白点在图像上的位置和已知的数据库进行比较来鉴定一些蛋白.现在国际上已有一些由权威研究所和公司开发的公共数据库,每个数据库都包含了大量的信息,并且在日益完善中.比如 SWISS-2DPAGE数据库,里面有许多标准的凝胶图像以及预测蛋白质在凝胶上位置变化的方法,可以用来比对分析以鉴定蛋白.但是由于技术上的差异(样本制备、IEF、SDS-PAGE、染色等)使每个实验室得到的蛋白质组图谱都不完全一样,这就给资源共享带来了很大困难,但随着操作技术标准化及自动化的逐步实现,信息资源的完全共享将成为可能.

3.4 双向电泳的技术缺陷

样本中实际蛋白浓度差可能达到 1000 000倍,而双向电泳最多只能显示 100倍的蛋白浓度差.双向电泳只适合用来分析高丰度范围的蛋白质,为了得到有意义的结果及提高分辨率,制备纯的蛋白质组(95%～99%)是必要的,而且由于生物质谱技术的高敏感性,如果蛋白质组被污染,将会导致蛋白质组被错误地注释,这就给操作带来了难度.另外许多蛋白质组学的检测技术都不是定量的(例如质谱技术),或者只在一定范围内定量(例如银染和考马斯亮蓝染色),这就使定量地研究蛋白质表达的正调节或负调节变得很困难,差异凝胶电泳和同位素代码标记的出现,对以双向电泳为核心的传统方法提出了创新和改进,为解决这个问题指出了一个方向.

4 双向电泳的发展前景

双向电泳技术当前面临的挑战:1)提高蛋白的溶解度和染色的灵敏度.2)低丰度蛋白以及难溶性蛋白的分离.3)在不影响分辨率的前提下提高上样量以提高 2-DE凝胶图像的分析和数据开发性能.4)缺乏灵敏可靠的蛋白检测手段和定量方法.5)极酸或极碱蛋白以及分子量极大或极小的蛋白的分离.6)要得到高质量的凝胶图像需要高度标准化的操作.

随着双向电泳技术体系的进一步发展,会不断出现新的样本处理方法、染色方法以及经过改进的电泳方法.例如目前流行的双向差异凝胶电泳(Two-dimensional different gelelectrophoresis,2-D DIGE)通过多元分析得到更多的蛋白质组信息,大大提高了凝胶之间的重复性和结果的可信度.

5 结语

综上所述,双向电泳的分辨率高,但重复性有待加强,蛋白质图谱资源有待共享化.虽然受到许多其他新技术的挑战,但其对于分离检测细胞、细胞系、器官和组织的总蛋白质组是最有效的方法之一,同时与其他蛋白质组研究技术(如生物质谱技术、蛋白质芯片技术、蛋白质复合物纯化技术、酵母双杂交系统等)互补长短,一起为解决这个领域的诸多问题发挥巨大作用.

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