RNA干扰抑制口蹄疫病毒复制研究进展*

徐 娜,刘 明,李宝玉,柳纪省

(中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,甘肃兰州730046)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性人兽共患传染病,其临诊症状多为口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须上报的动物传染病,我国将其列为一类动物传染病。该病宿主范围广,传播途径多,传播速度快,曾在世界范围内多次暴发流行,给各国造成严重的经济损失。仅2007年-2009三年间,世界各国就多次暴发口蹄疫,并造成了不小的损失[1]。因此,如何更好地控制或消灭FMD已成为各国兽医工作者的主要任务之一。近年来RNAi现象的发现为生命科学领域开辟了新天地。随着研究方法的逐步完善,科研工作者已经把RNA i应用到生物学研究的各个方面,RNAi技术同样也应用于口蹄疫病毒的相关研究中,这为FMD的防控带来新希望。本文就RNA i在宿主细胞内抑制FMDV复制的研究进展做一综述。

1 FMDV引起宿主细胞病变机制

FMDV侵染细胞,先决条件是吸附宿主细胞,而这种吸附过程依赖于宿主细胞受体。FMDV颗粒表面的宿主识别位点与细胞膜上的受体结合,病毒粒子经过胞饮作用或吞噬作用而进入细胞胞质中,然后将其核酸释放到靶细胞相应部位,在细胞内进行RNA复制、翻译和病毒装配。宿主细胞中溶酶体的酸性环境使病毒粒子周围的酶类降解,并诱导衣壳蛋白发生构想变化,衣壳蛋白膨胀,病毒基因组RNA经吞噬小泡膜上的孔道释放出来。FMDV与其他小RNA病毒成员相似,FMDV感染宿主细胞约6 h后,新形成的感染性病毒粒子开始出现,包装好的有侵染力的病毒颗粒在细胞中大量增殖造成细胞损伤、裂解、死亡,病毒粒子从而被释放到胞外,之后开始感染新的宿主细胞。

病毒感染宿主细胞导致细胞病变甚至死亡的机制主要有两个,一方面病毒产生的特异蛋白直接作用于细胞。病毒基因组RNA进入胞质后,随即以其自身基因组作为m RNA,利用宿主细胞翻译系统开始病毒蛋白的合成。随着病毒蛋白翻译合成,宿主细胞的帽依赖性m RNA的翻译受到抑制。小RNA病毒对宿主细胞蛋白质合成的抑制可能是病毒引起翻译起始因子失活,以及病毒RNA同宿主mRNA竞争有限的核糖体的结果[2]。另一方面是病毒感染机体后,刺激机体细胞产生细胞免疫间接诱导细胞死亡。其机制是病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡,或由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡。例如3C蛋白酶以及L蛋白酶可引起细胞凋亡。这两个蛋白具有蛋白酶活性,分别属于不同的蛋白家族,都能水解宿主细胞的翻译起始因子eIF-4A或eIF-4G,阻断宿主细胞的蛋白合成过程,结果导致宿主细胞的凋亡。当哺乳动物细胞感染FMDV后,翻译起始子eIF4A在胞内被分裂。LiW等[3]研究表明,感染FMDV的哺乳动物细胞的翻译起始因子eIF4A被3C蛋白酶在E143和V 144之间水解成N端和C端两个游离片段,使eIF4A失去活性。但3C蛋白酶不能裂解eIF4AII。当eIF4AI被修饰后,在分裂位点附近可产生与eIF4A II相同的序列,可以阻断蛋白质水解作用。Belsham G J等[4]研究发现在FMDV感染的细胞中,病毒基因编码的3C蛋白酶的积累与宿主细胞翻译起始子eIF4A和eIF4G的切割紧密相关。Hinton T M等[5]研究发现,FMDV的L蛋白酶在感染中是重要的决定簇,它拥有两种不同的催化水解的活性位点。L蛋白酶在L/VP4结合位点处的C末端突出水解活性,诱导分裂翻译起始子eIF4G;它的另一独特的特点是具有刺激肠道病毒内核糖体结合位点的活性。其结果抑制了宿主细胞蛋白质的合成,最终导致宿主细胞死亡。

研究发现,小RNA病毒科的2B和2C非结构蛋白已被证实与细胞病变有关。当FMDV感染宿主细胞后,能阻断宿主细胞蛋白质分泌途径,这是由于FMDV非结构蛋白2BC阻断了参与蛋白运输的内质网(endop lasm ic reticu lum,ER)高尔基体途径。通过试验,研究机体分泌途径时发现,只有在2BC共同作用时才能阻断宿主细胞的分泌途径,而2B和2C单独存在时,不能阻断宿主细胞的分泌途径。因此,FMDV阻断蛋白质分泌依赖于2B和2C,2C决定阻断位点的位置[6]。M ercedes G B等[7]利用免疫荧光技术检测了感染FMDV的BHK细胞质中的2B和2C分布情况,发现他们散落在细胞质中,这样可有效阻止宿主蛋白分泌,引起宿主细胞病变甚至死亡。

2 RNA干扰的机制

RNAi是一种序列特异性的转录后基因沉默过程,它通过一个短双链RNA(dsRNA)分子引起具有相同序列的m RNA发生降解来关闭相应的基因表达活性的过程[8-9],已经作为一项新兴的基因沉默工具在抗病毒研究领域体现出独特的优势。参与RNA i作用的分子主要有siRNA s、寻标酶(A rgonaute)、切丁酶(Dicer)、切段酶(Slicer)、RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing com plex,RISC)[10]。

siRNA是真核细胞中的dsRNA经Dicer切割降解形成分子质量大小为21 bp～25 bp的dsRNA分子,siRNA两端有2个单核苷酸延伸,是RISC确定作用目标和m RNA结合的序列。A rgonaute是位于RISC的中心部位的一种重要蛋白家族,分子质量约100 kb,与RNA i反应有关,简称AGO酶。A rgonaute具有2个结构域,分别为PAZ和RIW I。PAZ位于AGO酶的中心部位,能与siRNA 3′端结合;RIW I位于AGO酶的C端,能与m RNA分子结合,它是M g2+依赖的Rnase H的结构同系物,它可以在靶RNA易断裂的磷酸基团处进行切割[11]。Dicer酶属于核糖核酸内切酶(RNaseⅢ),具有解旋酶活性,含dsRNA结合区以及PAZ结构区,它在细胞中将dsRNA加工裂解为siRNA s[12]。Slicer是RISC中的主要组成部分,主要是把目标m RNA靶序列切成两段。RISC含Dicer-2蛋白(Dcr-2),R2D2蛋白,A rgonaute蛋白。RISC的作用是对靶mRNA进行识别和切割,在RNA及蛋白质因子Argonaute的作用下,诱导靶m RNA的特异性降解。Dcr-2蛋白指导siRNA的一条链进入RISC复合体,R2D2具有dsRNA结合结构域,与Dcr-2都是RISC中siRNA解链必需的[13]。

dsRNA介导的同源性靶m RNA降解过程主要分为两步[14]。第一步(起始阶段)为较长dsRNA在ATP参与下被Dicer切割加工成21 bp～25 bp的由正义链和反义链组成的siRNAs。siRNAs的两条单链末端为5′磷酸和3′羟基,且3′端均有2个～3个突出的核苷酸。第二步(效应阶段)是位于RISC复合物中心部位的AGO蛋白,通过AGO蛋白的PAZ结合域,与ds-siRNA结合,在结合siRNA之后,RISC复合物进入激活的状态,利用A TP提供的能量在RNA解旋酶参与下ds-siRNA被解旋成单链。活化的RISC复合物在单链siRNA引导下识别mRNA中的靶序列,引导Slicer在m RNA分子中与单链siRNA结合的部位切割靶m RNA分子。被降解的m RNA片段和未降解的完整mRNA均可作为引物,在RdRP作用下合成更多dsRNA,新合成的dsRNA进入下一轮的RNAi循环,从而对RNAi效应起放大作用。

3 RNAi抑制FMDV在宿主细胞内复制

FMD灭活疫苗一般是在接种7 d后才能产生保护性抗体,而FMDV的复制和传播速度相当快,动物感染FMDV 2 d后,病毒复制达到高峰,便可出现典型的临床症状。因此,在这方面,目前传统的灭活疫苗不能完全同步地保护受威胁动物免受FMDV的侵犯。但是,RNA i技术能迅速且有效的保护动物抵抗FMDV的感染,并增强机体抗病毒能力,可以弥补传统抗病毒策略的不足,有利于控制FMD的暴发。

3.1 RNA i抑制FMDV复制策略

FMDV的宿主识别位点主要由VP1的三肽序列A rg-Gly-Asp(RGD)组成。RGD序列是多种细胞外蛋白与细胞表面整联蛋白受体作用的通用识别位点,介导病毒对细胞的感染。RNAi已作为一种有效的抗病毒方法,它通过沉默哺乳动物细胞中基因表达而起到抗病毒作用。Lv K等[15]根据T7RNA聚合酶设计并合成与FMDV VP1基因相应的siRNA s。试验证明,5个siRNAs与质粒pVP1-EGFPN形成VP1-EGFP融合蛋白和siRNA共转染到293T细胞,对病毒显示出巨大的序列特异性的沉默效应。并且,利用RT-qPCR、病毒滴度和活力分析表明,当FMDV感染BHK-21细胞时,VP1-siRNA 517、VP1-siRNA 113和VP1-siRNA 519在FMDV复制中充当短暂的蛋白抑制剂。据了解,FMDV多位点区域的变异揭示出FMDV基因序列高突变率,而且基因组中单核苷酸置换可以被鉴别出,这种突变可以抵抗RNA i。由于FMDV结构蛋白VP1基因是变异率最高的区段,而siRNA对基因的抑制又存在高度特异性,所以,FMDV的保守区段是比较理想的靶序列。因此,RNAi技术的应用主要着手于FMDV保守区域的研究。

3.2 RNA i抑制FMDV增殖最新研究进展

Delos Santos T等[16]利用质粒表达短小发夹结构RNA(short hairpin RNA,shRNA),直接作用于编码FMDV的保守区2B非结构蛋白的RNA。当病毒感染细胞后,这些细胞能显著地抑制FMDV RNA和蛋白质的合成,并且细胞内病毒数量明显少于对照组。该研究证明针对RNA病毒保守区设计合成siRNA抑制病毒的复制是可行的。从试验结果可知,RNA i可能成为预防或紧急治疗FMDV感染的可行方法。Joyappa D H等[17]利用shRNA作用于FMDV的2个区域3D和5′-UTR(它们是病毒复制中必不可少的组成部分)构建h7K RNA聚合酶Ⅲ启动子,研究shRNA在BHK-21细胞和豚鼠体内抗FMDV复制的能力。试验结果显示,用102TCID50 FMDV攻击转染3DshRNA的细胞时,能降低病毒在细胞中的生长速度。100μg shRNA表达质粒通过颈部皮下注射豚鼠,80%豚鼠能抵抗102TCID50 FMDV的攻击(豚鼠是第一个被报道的用于FMD疫苗保护试验的模式生物)。这一研究表明,shRNA是一种有效控制FMDV感染和扩散的方法。另外,韩晓荣等[18]新近首次根据口蹄疫基因疫苗的已有研究基础和存在的问题,利用反义核酸能够抑制病毒复制的特点,在逆转录表达载体的不同多克隆位点时分别插入了一段反义核酸免疫基因,使反义核酸在免疫空白期能够抑制FMDV的复制。Pengyan W等[19]利用计算机程序中的生物信息学的知识对FMDV基因组序列进行同源性分析,可知3D和2B1是2个特效的siRNA靶位区,利用FMDV的7个血清型构建2个siRNAb表达载体pSi-FMD2和pSi-FM。siRNA表达载体用来检测siRNAs在BHK-21细胞和乳鼠上抑制病毒复制的能力。试验结果证明转染siRNA表达的质粒的BHK-21细胞,能显著的降低细胞病变的发生。并且,转染shRNA表达质粒的BHK-21细胞,能抵抗FMDV A型,O型和Asia I,这种抗病毒效应能持续存在48 h。通过检测转染抗FMDV的siRNA s细胞的病毒滴度,半数组织培养感染量(50%tissue culture in fective dose,TCID50),可知病毒滴度、TCID50均低于对照组。而且,通过颈部皮下注射siRNA表达质粒载体,乳鼠感染O型和A sia I型FMDV的机会显著降低。

Chen W等[20]采用人重组腺病毒为载体表达siRNA,并评估了其在IBRS-2细胞、豚鼠及家猪中对FMDV的抑制效应,结果表明,腺病毒能够完全抑制FMDV在细胞水平的复制;在豚鼠试验中,腺病毒的抑制效应亦十分显著,但无论如何改变试验条件动物均无法获得100%保护,在FMDV易感动物家猪中,颈部肌肉注射腺病毒能够明显减轻FMD症状,降低血清中FMDV的抗体水平,这是世界上第一个有关RNA i在FMDV易感动物水平有效性的评估工作。在体外试验中,RNA i能够有效的抑制病毒的复制,Chen W等[21]进一步利用复制缺陷型的人腺病毒5型(adenovirus type5,Ad5)为载体表达shRNAs,shRNAs能够直接抵抗FMDV结构蛋白1D(Ad5-NT21)或聚合酶3D(Ad5-POL),当猪IBRS-2细胞接种shRNAs后可以完全抵抗同源FMDV的感染,但仅仅Ad5-POL能够抑制同源FMDV的复制。体内产生的sh RNAs能显著降低易感动物(如豚鼠和猪)感染FMDV的敏感性。用106PFU Ad5-POL接种豚鼠,24 h后用同源FMDV攻击,有60%的豚鼠能够抵抗半数感染量(50%infectious doses ID50)的病毒。猪接种含有2×109p fu的A d5-NT21-Ad5-POL混合物,24 h后用同源病毒100ID50对猪进行攻毒,60%猪能抵抗FMDV的攻击,但高剂量的腺病毒混合物并不能增强动物的保护性。试验证明,在动物体内RNAi技术能抵抗FMDV。金红等[22]通过对国内流行FMDV毒株的序列分析,锁定RNA干扰的3个目标基因即3D,VP4和2B,分别编码聚合酶POL,病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B,这3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保守。分别设计合成靶向这些基因序列的shRNA表达模板,构建了5个shRNA表达质粒p3D-NT56、p3D-NT19、pVP4-NT65、pVP4-NT19和2B-NT25。进行单独应用或混合应用,于细胞水平和乳鼠水平检测其抗病毒活性。结果显示,3DNT56/19、VP4-NT65/19和2B-NT25shRNA对O型FMDV均有抑制作用,但是对AsiaⅠ型FMDV,仅2BNT25shRNA具有较显著的抑制作用。3个shRNA表达质粒(p3D-NT56+pVP4-NT65+p2B-NT25,p3DNT19+pVP4-NT19+p2B-NT25)的混合使用,不仅能够交叉抑制不同血清型FMDV的复制,而且这种抑制作用较单一shRNA延续更长的时间。

由此可见,RNAi技术在防控FMD方面,将具有独特作用,这也为最终消灭FMD带来希望。

4 展望

随着蛋白质组学的不断发展,RNAi技术作为一项新兴的基因沉默工具越来越引起人们的关注,此项技术覆盖生命科学研究的各个领域。RNAi能抑制病毒的复制,引起细胞凋亡,目前已在抗病毒、抗肿瘤、鉴定基因功能、信号转导等研究领域体现出独特的优势,备受广大科研工作者青睐。

在未来的FMDV研究中,应针对病毒基因序列的保守区,设计带有标记的RNAi基因片段,同时解决合成的RNAi基因片段能在宿主细胞内持续存在问题,将有助于研究宿主细胞阻断病毒复制机制和某些未知基因的功能,并为研制新型抗病毒药物奠定基础。

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