植酸酶转基因动物的研究进展

王 爽 冷义福 张守纯 沈阳农业大学68号信箱，辽宁沈阳 110161

植酸酶是近年来开发和应用的一类新环保型饲料添加剂，它能将饲料中丰富的植酸及其络合物分解为能被畜禽利用的无机磷和肌醇，提高了饲料潜在的营养价值和畜禽机体骨骼矿化程度，降低畜禽粪便中磷的排放量从而减轻对环境的污染[1]。由于动物营养和环保的原因需要在饲料中添加植酸酶，而植酸酶是催化植酸水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称，有植物、动物和微生物3种来源，根据其理化性质分为酸性、碱性和中性植酸酶，不同来源的植酸酶最适反应温度不同，大多数有不耐热的缺点。因此开发热稳定性较好的植酸酶是当务之急[2]。

1 植酸酶的理化性质

植酸酶的理化性质因其来源不同，最适pH值、最适温度和热稳定性等方面有一定差异。

1.1 植酸酶的最适pH值

植物来源的植酸酶最适pH值一般在5～7之间，在pH3.0时，大多数植酸酶活性下降、甚至失活，不适合在酸性环境下起作用。细菌来源的植酸酶最适pH值一般为中性或偏碱性。真菌植酸酶的最适pH值为2.5～7.0。黑曲霉NRRL3135能产生两种不同的植酸酶，一株最适pH值为5.5和2.5(phyA)，另一株最适pH为2.0(phyB)，两种菌株发酵和生产的植酸酶，经体外试验发现：在pH值为2.5和5.5时活性最强，可能是因为pH为2.5时，与胃中的酸碱度相接近；pH为5.5时属于肠道pH值变化范围内(夏立秋，2001)。 Newman D(1994)等人在1994年发现由Aspergi11us niger产生的植酸酶在pH为5.0～6.5时，具有最强的活性。另外，也有碱性植酸酶最适pH值为8.0的报道。总之，不同来源的植酸酶最适pH值存在差异。

1.2 植酸酶的最适温度和热稳定性

植酸酶的最适温度在40℃～60℃范围内，不同来源植酸酶的最适温度相差也较大。由于饲料加工的制粒工艺中有一个短暂的高温过程，温度在75℃～93℃之间，一般的植酸酶活性在此高温下不可避免的发生失活。从嗜温微生物中分离到的高温植酸酶其最适温度在70℃～80℃，虽然有很好的耐温性，但它在37℃下的酶活性极低，没有使用价值；而来源于黑曲霉等的植酸酶在37℃下具有较高酶活性，但它又不能经受制粒时的高温。所以能在饲料中真正得到推广利用的植酸酶必须是具有良好的热稳定性[3]。目前，在酶的耐热性方面已有许多富有成效的研究，一种较简单而有效的方法就是采用酶的包被技术，将酶包裹在包衣中免受制粒高温的破坏，包衣在动物胃中可被消化而释放出酶。欧洲的一种常用方法是把液态植酸酶制剂洒在制成的颗粒料上，或使用冷压制粒。现有酶的包被、缓释技术，可以同时解决酶的耐高温以及保持高酶活的问题，但是加工成本较高，难以大批量地应用于生产。所以，如何使酶既能短暂耐高温又能在动物体中具有高活性，是目前饲料用植酸酶制剂急需解决的一个问题[4]。

2 植酸酶应用现状

2.1 植酸酶作为饲料添加剂的应用

到目前为止，植酸酶虽然在饲料中作为饲料添加剂得到广泛的推广应用，但仍然存在一些缺点∶1.植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性即高温失活(80℃)不能满足饲料及饲料加工的要求。加工饲料都需经过一个制粒工艺，在制粒过程中有一个短暂的高温过程，温度大多在75～93℃，一般的植酸酶活性在此高温度下大幅度地不可逆丧失[5];2.饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性，因为饲料用酶最终的作用场所是动物正常体温(37℃左右)的胃肠道中，这与工业上所使用的一些高温酶不同;3.从噬温微生物等中分离到的高温植酸酶其最适温度70～80℃，虽然具有较好的耐温性，但它在37℃下酶的活性极低，在饲料中没有利用价值;4.储存过程中酶活性的丧失等诸多因素的限制等[6]。

2.2 植物基因工程生产植酸酶的应用

利用植物转基因工程来生产植酸酶也正在发展阶段。目前，在烟草种子[7]、大豆[8]中获得表达植酸酶的转基因植物。然而，在制粒和储存过程中仍然存在酶活稳定性问题。降低植物饲料中植酸含量的植物基因工程研究也正获得进展，例如，植酸含量降低65%的转基因玉米[9]，能够降低饲料中添加植酸酶的量，但是，如果向饲料中添加无机磷对猪和家禽的生长还是有好处。低植酸转基因谷物的发展潜力还不能肯定，因为与对照相比，低植酸含量谷物表现为发芽率低和产量下降[10]。

3 植酸酶转基因动物

植酸酶的热稳定性研究目前还处于知识积累阶段，目前还很难取得大的突破。随着基因工程技术的发展尤其是转基因动物生产技术的提高，为这些问题的解决提供了一条有效的新途径，通过猪和禽类等单胃动物的内源性消化道来产生具有较高生物活性的内源性植酸酶已经成为解决单胃动物高磷粪便污染的一种研究策略和手段。

内源性的植酸酶可以增加植物植酸盐的生物学活性，并可以降低动物生产中磷的排出，解决环境污染和环境生态的难题，也解决了转基因植物中饲料加工和贮存酶失活等问题，同时由于植酸盐的分解解除了其抗营养作用，可以促进动物的生长发育，提高饲料利用率。在这方面Go1ovan等在小鼠的唾液腺中表达了E.co1i植酸酶基因appA产生了转基因小鼠，发现在唾液中含有糖基化的蛋白。唾液腺中植酸酶的表达导致粪便中磷的降低，这表明它提供了一种减少动物饲料中磷的添加以及畜牧中磷污染的途经，已经以唾液腺为生物反应器做了成功的尝试，使转基因小鼠和猪等单胃动物粪便中磷含量大大地降低[11]。可以说通过转基因动物自身分泌内源性的植酸酶来解决这些问题，是一种一劳永逸的方法。

3.1 植酸酶基因在动物体内的表达系统

（1）唾液腺生物反应器

唾液腺生物反应器是一类最近才发展起来的新型生物反应器。其特点是利用唾液分泌蛋白的调控区在唾液腺中特异性表达各种酶类和人类基因治疗的蛋白。常用的唾液分泌蛋白为腮腺分泌蛋白PSP,a-唾液淀粉酶a-Amy和富含脯氨酸的蛋白Pro-rich。Mastrange1i等利用腺病毒调控的a抗胰蛋白酶基因载体转染唾液腺，结果导致a抗胰蛋白酶在唾液中表达。利用唾液腺生物反应器在表达人基因治疗蛋白方面也获得了很大进展，M ikke1sen等利用小鼠腮腺分泌蛋白基因的调控区构建人血凝结因子V111表达载体，在小鼠的唾液腺中成功地表达了人血凝结因子Vi11。这些结果为唾液腺作为生物反应器的可行性研究做了有效的尝试[12]。

（2）唾液腺生物反应器的优势

唾液腺组织分泌物很容易通过导管进入到口腔;唾液腺细胞能够合成和分泌大量的蛋白∶唾液中合成和分泌的物质能够源源不断进入到体内;唾液的分泌不受性别和发育时期的限制，动物的一生都分泌唾液，而且大家畜的唾液分泌量大，容易收集纯化;另外，唾液腺生物反应器不像血液生物反应器受所表达蛋白的种类限制。正是唾液腺的这些突出的特色，使得唾液腺生物反应器越来越呈现出勃勃生机，被寄于厚望用唾液腺表达一些饲料中需添加的酶类，如植酸酶、葡糖昔酶、木聚糖酶等，来改善家畜和家禽的生产性状，对整个畜牧产业是非常重要。

（3）植酸酶在唾液腺生物反应器的表达

在单胃动物，如猪、鸡和鸭等家禽产业上，植酸酶的添加非常迫切，主要是由于单胃动物体内缺乏内源性植酸酶，使饲料中的植酸磷不能被有效分解、吸收，而随粪便排放出，造成了严重的农业磷污染[13]。Go1ovan等建立了可以在唾液腺中分泌植酸酶的转基因小鼠模型。该研究中所采用的表达系统为由可诱导的大鼠富脯氨酸蛋白(inducib1epro1inerichprotein,PRP)启动子和小鼠组成型腮腺分泌蛋白(constitutive parotidsecretoryproten,PSP)启动子来调控的大肠杆菌植酸酶appA墓因在唾液腺中的表达。该基因所编码的植酸酶己倍证实对于禽类的植酸盐作用效果非常明显。通过对转基因小鼠的分析被证实对于禽类的植酸盐作用效果非常明显。通过对转基因小鼠的分析结果表明，所生产的转基因小鼠的唾液腺中植酸酶的分泌可以导致小鼠粪便中磷水平的显著降低。该实验室用同样的系统获得了植酸酶转基因猪，其粪便中磷含量降低了56-67%，大大缓解环境中磷污染 (Go1ovan SP.et a1.,2001)。其转基因表达的效果可以通过与非转基因猪的对比研究阐明，在以豆粉为唯一的磷源时，转基因猪在断奶仔猪和育成猪的磷消化率几乎达到了100%，而非转基因猪只有50%[14]。而对粪便的检测中，与非植酸酶转基因猪相比较，植酸酶转基因猪的粪便磷含量在断奶仔猪和育成猪分别降低了56%和75%饲料利用率有明显的提高，而且通过转基因猪所产生的植酸酶对植物中所含有的植酸盐的水解作用完全可以替代无机磷的添加[15]。

4 展望

转基因动物技术自产生之日起就显示出勃勃生机，并被寄予厚望。一方面希望可以利用转基因技术作为动植物育种的强有力工具，将符合人类期望的优良性状基因通过生物工程手段使之重组于某些动物品种，以期改良动物的生产性状;另一方面转基因技术在生命科学的诸多领域也显示出巨大的潜力[16]。近年来，动物转基因技术发展的相当迅速，转基因猪的技术也己经非常成熟。因此植酸酶转基因动物对内源性植酸酶降低粪便磷代谢，解决单胃动物粪便中高磷污染,提高植酸酶的热稳定性，这些问题最有前途和最有利的方法，为建立一种可持续发展的农业动物饲养模式，并育成环保型畜禽提供应用前景和商业价值。

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