生物碱的分类和鉴定方法研究进展

张德华,李 茹,王永梅,朱晓芸,王彦彦

(1.皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安 237012;2.安徽省植物生物技术实训中心,安徽六安 237012)

生物碱的分类和鉴定方法研究进展

张德华1,2,李 茹1,王永梅1,朱晓芸1,王彦彦1

(1.皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安 237012;2.安徽省植物生物技术实训中心,安徽六安 237012)

生物碱是广泛存在于自然界天然植物中的碱性含氮有机化合物。大多数生物碱具有显著的生理活性,是许多药用植物的有效成分。本文综述了近年来生物碱的分类与鉴别方法及其应用与进展。

生物碱;分类;鉴定;进展

生物碱(alkaloids)一般指存在于生物体内的碱性含氮化合物,多数具有复杂的含氮杂环,有光学特异性和显著的生理效应[1](P329)。但也有少数生物碱例外,如麻黄碱是有机胺衍生物,氮原子不在环内[2-3];咖啡因虽为含氮的杂环衍生物,但碱性非常弱,或基本上没有碱性[4];秋水仙碱几乎完全没有碱性,氮原子也不在环内等[5-7]。由于它们均来源于植物的含氮有机化合物,又有明显的生物活性,故仍包括在生物碱的范围内。而有些来源于天然的含氮有机化合物,如某些维生素、氨基酸、蛋白质、核苷等,习惯上又不属于生物碱,所以“生物碱”一词到现在还未有严格而确切的定义。

某些生物碱因其具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗血小板凝集、抗心律失常以及抗高血压等心血管疾病的功能,在卫生、医药等方面有着巨大的应用潜力,近年来成为人们研究的热点。

1 生物碱的分类

生物碱是生物体次生代谢产物中较大的一类,目前已分离出的生物碱约有1万多种。而且不断有新的生物碱被发现[8](P23-29)。生物碱种类繁多,结构复杂,来源不同,分类方法众多,文献量巨大,多数与中药制剂相关。

1.1 按其植物来源分类

常见的有毛茛科生物碱、百合科生物碱、罂粟科生物碱、茄科生物碱等[8](P23-29)。例如,烟草主要含烟碱、去甲烟碱和毒黎碱等;雷公藤主要含雷公藤碱、雷公藤精碱、雷公藤次碱、雷公藤春碱和雷公藤辛碱等;苦参主要含苦参碱、氧化苦参碱、羟基苦参碱、N -甲氢野靛碱和脱氢苦参碱等。

1.2 按其药理作用分类

如对心血管系统的作用、抗肿瘤作用、对中枢神经系统的作用、降脂作用、降血糖作用、抗菌、抗病毒、杀虫作用、对平滑肌作用、对免疫功能的影响、抗炎作用、其他作用等[9,10]。

1.3 按物理化学性质分类

如挥发碱、酚性碱、弱碱、强碱、水溶碱、季铵碱等;液体生物碱、挥发性的生物碱、升华性的生物碱、甜味的生物碱、有颜色的生物碱等。

1.4 按其代谢来源分类

常见有鸟氨酸类生物碱、赖氨酸类生物碱、邻氨基苯甲酸类生物碱、色氨酸类生物碱、萜类生物碱、甾类生物碱七大类,每类又分若干组。

1.5 按其结构分类

(1)吡啶衍生物类[8](P23-29)[11](P53)[12](P7)[13](P313-322),包括简单吡啶类及双稠派啶类。如烟碱、金雀花碱、半边莲碱、槟榔碱、苦参碱等。(2)吡咯啶衍生物类[14],此类生物碱指五环(吡咯烷)或六环(派啶)中存在一个氮原子的生物碱。如红古豆碱、野百合碱等。(3)茛菪烷衍生物类,莨菪烷是由四氢吡咯和六氢吡咯并合而成的杂环。莨菪碱是由莨菪醇和莨菪酸缩合而生成的酯。如莨菪碱、阿托品、古柯碱等。(4)异喹啉衍生物类,它们的结构基于四氢异喹啉核,主要由苯丙氨酸或酪氨酸生物合成而来。这些生物碱都是芳香碱基,具有不同数量的羟基、甲氧基以及亚甲基二氧取代基。如小檗碱、罂栗碱、吗啡等。(5)菲啶衍生物类,如白屈菜碱、石蒜碱等。(6)吲哚衍生物类,此类生物碱是从色氨酸生物合成而来,包括简单吲哚类和二吲哚类衍生物。如长春花碱、麦角新碱、麦角胺、利血平等。(7)吡嗪衍生物类,如川芎碱等。(8)喹唑酮衍生物类,如常山碱等。(9)嘌呤衍生物类,由嘌呤衍生的生物碱,在植物界分布较散。如咖啡碱、香菇嘌呤等。(10)喹啉衍生物类,由(邻)氨基苯甲酸生物合成而来,具有一个双环结构,即一个苯环与一个吡啶环相连接。如蓝刺头碱、茵宇碱、奎宁、喜树碱等。(11)咪唑衍生物类,如毛果芸香碱等。(12)有机胺类,此类生物碱的化学结构特点是氮原子在环外侧链上,如麻黄碱、秋水仙碱、益母草碱等;(13)甾体生物碱,此类生物碱包括甾类生物碱和异甾类生物碱,氮原子大多数在甾环中,有的以与低聚糖结合的形式存在,如藜芦碱、茄碱、贝母碱等。(14)萜类生物碱,其氮原子在萜的环状结构中或在萜结构的侧链上,单萜类生物碱由异戊二烯化合物与氨的缩合生物合成而来。还有一些单萜类生物碱化合物具有较为突出的胍基取代。如龙胆那宁、猕猴桃碱、石斛碱、关附甲素、乌头碱等。(15)大环生物碱,大多数具有内酯结构,故亦称为大环内酯类生物碱,如美登木碱、番木爪碱等。(16)其他[15](P3-31),如千金藤碱、哈林通碱等。

2 生物碱的鉴定方法

生物碱的鉴定包括结构鉴定和含量分析。

2.1 物性测定

测定化合物的溶沸点、比旋光度等物理参数,与已知生物碱的物理参数进行比较[16](P48-118)。沉淀反应是鉴定生物碱的定性反应,方法简单、快捷,可直接在生物碱提取液中滴加生物碱显色剂,出现特征颜色沉淀物。肖桂青等[17]在荷叶生物碱提取液中分别滴加碘化铋钾、硅钨酸、碘化汞钾、碘-磺化钾试剂,分别出现桔红色无定形沉淀、灰白色无定形沉淀、白色无定形沉淀和红棕色无定形沉淀。

2.2 化学降解反应

为经典的结构测定方法,将分子降解为几个稳定的碎片,它们通常是一些比较易于鉴别或可通过合成证明的简单化合物,然后按降解原理推导出原来可能的化学结构。常采用霍夫曼降解、布朗反应和埃姆特降解[14]。或用脱氢方法使化合物转为易于鉴别的芳香化合物,再推导其结构。这些方法不足之处是费时费料,结果较差。

2.3 氧化反应

是一种应用于生物碱结构研究的方法,即通过将化合物氧化裂解成小分子化合物推知该化合物环状结构的类型和取代基的种类及位置。常用的氧化剂有较温和、中等强度和较强等多种。如根据罂粟碱用高锰酸钾中性溶液和酸性溶液氧化的产物结构可推导出罂粟碱的结构。

2.4 滴定法

滴定法的原理是酸碱中和反应。人工滴定法是根据指示剂的颜色变化指示滴定终点,然后目测标准溶液消耗体积,计算分析结果。自动电位滴定法是通过电位的变化,由仪器自动判断终点[18]。滴定法简便、经济、快速,但相对标准偏差较大。

杨长府等[19]在烟叶样品处理中加入Ba(OH)2,用 HClO4-冰醋酸在苯-氯仿体系中准确测定了烟叶中的烟碱。赵红侠[20]以氢氧化钠为滴定液,一阶导数法确定终点,并与标准方法进行比较,测定结果的精密度和准确度比非水滴定好。

2.5 紫外吸收光谱法(ultraviolet absorption spectrometry,UV)

不少生物碱具有引起紫外吸收的共轭系统,有的生物碱母核为完整的共轭系统,如喹啉类、吡啶类、简单吲哚类等;而大多数生物碱的共轭系统只是其结构的一部分,如具有四氢异喹啉结构的生物碱等。对于母核为完整共轭系统的生物碱,其UV光谱可反映其基本结构的特点。共轭系统若只是生物碱的部分结构时,则共轭系统的组成、共轭系统的大小,以及共轭系统中助色团的种类、位置和数量对UV光谱将产生影响。溶液的p H值对生物碱的紫外吸收有明显的影响。该法操作简单、准确度高、重现性好。

崔盛等[21]根据二帖类生物碱和酸性染料溴甲酚绿在酸性缓冲液中形成的络合物能被氯仿提取,并且提取液在415nm处具有吸收值的原理,运用酸性染料比色法测定了四川境内乌头属植物总生物碱的含量。

2.6 红外光谱法(infrared absorption spectroscopy, IR)

红外光谱法利用物质对红外光区电磁辐射的选择性吸收来进行结构分析及对各种吸收红外光的化合物的定性和定量分析。被测物质的分子在红外线照射下,只吸收与其分子振动、转动频率相一致的红外光谱。生物碱红外光谱主要用于结构中官能团的定性鉴定,或用于与已知结构生物碱进行对照鉴定。该法特征性强、测定快速、不破坏试样、试样用量少、操作简便、能分析各种状态的试样,但分析灵敏度较低、定量分析误差较大。

王家俊[22]应用傅立叶变换红外光谱法(FTNIR)测定了近1000个具有代表性的烤烟样品的近红外光谱数据。

2.7 质谱法(mass spectrometry,MS)

质谱法是将物质分子转化为离子,按质荷比差异进行分离和测定,实现成分和结构分析的方法。从质谱(MS)中,不仅能通过分子离子峰再结合氮规则判断含氮原子的个数,而且可得到生物碱分子量、分子式的信息,还能通过碎片离子给出的裂解方式获得分子结构信息。

电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)是近年来迅速发展并逐步完善起来的一种软电离质谱,特别适用于极性大、热不稳定的天然化合物分析。因其具有高特异性、高灵敏度及多级质谱(MSn)等技术特点,故可以直接进行混合物的微量分析。

陈怀侠等[23]研究了苦参碱和氧化苦参碱的电喷雾一级质谱电离规律和二级质谱碎裂规律,总结出苦参碱类生物碱的特征裂解规律,而且通过苦参对照药材生物碱提取物的一级和二级质谱测定,对已知成分进行认证,为苦参药材质量控制提供了新的方法。陈焕文[24]利用电喷雾解吸电离质谱(DESI-MS)快速测定吴茱萸中有重要活性的5种生物碱结构。由于在大气压下进行操作(样品更换等较便利)和不需要样品预处理,使得DESI适合于进行现场、在线分析,具有灵敏度高、速度快、特异性好等特点。

2.8 核磁共振谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)

氢核磁共振谱(1H NMR)和碳核磁共振谱(13C NMR)能揭示结构中各官能团的种类和周围的结构状态,在生物碱结构测定中具有重要价值。胡明华等[25]先用酸水提取安徽小檗生物碱,再用硅胶柱色谱分离纯化,然后用核磁共振法鉴定出其中含有小檗碱、巴马汀、dehydrocapaurinine、药根碱、非洲防已碱、jatrorubine等6种生物碱。李宁等[26]从鹅掌楸中分离得到3个7-氧代阿朴菲型生物碱,采用MS、1D NMR和2D NMR等技术确定了化合物的结构,并利用2D NMR技术对其核磁共振信号进行了全归属。

2.9 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)

HPLC具有高效的分离效能、较宽的适用范围、条件优化的灵活性、灵敏度高、重现性好、样品易回收和色谱柱可反复使用等优点,因而在生物碱分析中得到了广泛应用。根据HPLC分析生物碱时所使用的固定相的性质、流动相的组成及极性大小,其分析模式大致可分为正相吸附色谱法、正相硅胶-反相洗脱系统色谱法、离子交换色谱法及反相高效液相色谱法。刘正聪[27]利用超声萃取-超高效液相色谱法测定可替宁、降烟碱、麦斯明、新烟碱和烟碱5种烟丝生物碱向主流烟气的迁移率。

2.10 气相色谱法(gas chromatography,GC)

以气体为流动相的色谱方法,广泛应用于生物碱的定量分析。气相色谱的定量方法主要有三种:内标准法、标准曲线法和峰面积百分率法。高志强[28]利用气相色谱仪对湖南3个等级559个烟叶样本的生物碱,采用内标法进行定量分析,研究湖南烤烟生物碱含量的地理分布特征及与生物碱含量之间的相关性。

2.11 薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)

薄层色谱是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。若采用薄层扫描仪对色谱斑点进行扫描,与对照物所得的色谱图作对比可以实现定量分析。TLC法兼备了柱色谱和纸色谱的优点,适用于少量样品(几微克,甚至0.01μg)的分离。

凌育赵[29]采用薄层色谱分离白毛茶的多种生物嘌呤碱,测其总生物碱为4.68-4.89%,平均回收率97.13%。

2.12 超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,SFC)

SFC是以超临界流体作流动相,以固体吸附剂或健合到载体上的高聚物为固定相,其分离机理与CG和LC是一样的,是分析难挥发、易热解物质的有效方法。具有分离效率高、方便快捷、后处理简单、无污染等优点。梁宝钻等[30]在对亚东乌头总生物碱提取和含量测定分析时,研究了碱化试剂、萃取压力、夹带剂、表面活性剂对实验的影响。

2.13 毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE)

CE是电泳技术和色谱技术相结合的产物,具有高灵敏度、高分辨率、高速度、样品少和成本低等特点,是近十几年来发展较快的一种分离分析技术,广泛应用于生物碱的分析测定中。张兰[31]依据毛细管区带电泳的特性,建立了用毛细管电泳-电化学检测法研究四种生物碱:苯异丙胺、苯丙醇胺、麻黄碱和甲基麻黄碱电离常数的线性模型和测定方法,结果令人满意,可望在药物离解常数测定应用中得到推广。

2.14 胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC)

MECC是在缓冲液中加入表面活性剂,如SDS,在缓冲液中添加的表面活性剂具有吸附、增溶、形成胶束等功能,当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时,便形成荷电胶束。离子化胶束在电场作用下泳动,溶质在胶束和水相间分配。因为不同溶质在两相间的分配系数不同,溶液的电渗流和胶束的电泳速率差异使它们得到分离。分离效率可与毛细管区带电泳相比拟,MECC是唯一的既能分离电中性组分又能分离带电组分的电泳技术,对某些离子化合物也能改善峰形和选择性。

宋冠群等[32]采用胶束电动毛细管色谱法建立了茶叶的色谱指纹谱并用于分析10种中国名茶。该方法将色谱图转换成数据表,实现了图谱的数据化;并且以相对保留值表示各色谱峰的峰位,大大减少了各种操作条件对色谱相对保留值的影响,降低了色谱峰峰位变化的波动性,提高了样品间的可比性。这种色谱指纹谱在没有标准品的情况下也可得出可靠的、有意义的结果。

2.15 分子印迹法(molecular imprinting technology,MIT)

MIT是近年来迅速发展起来的一种高选择性分离技术,利用具有分子识别功能的分子印迹聚合物(molecule imprinting polymer,MIP)为固定相,对目标分子进行分离、筛选、纯化的一种高选择性仿生技术,其技术该心是通过印迹、聚合、去除印迹分子3步制备分子印迹聚合物(MIP),以其特定的分离机理而具有极高的选择性。董襄朝等[33]以左旋麻黄碱为模板分子,甲基丙烯酸为功能单体,使用不同的交联剂和致孔剂合成的MIP对烙印分子具有很好的亲和能力及选择性。

MIP最大的特点就是对模板分子的识别具有可预见性,对于特定物质的分离极具针对性。具有抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点[34]。

3 展望

生物碱的种类繁多,不同的提取纯化方法有所差异,对生物碱的质量影响很大,并直接涉及到分析鉴定效果。上述生物碱的鉴定方法有其各自的特点和适用范围,应根据生物碱的性质和实际需要,灵活选择不同的鉴定方法。

多种检测方法联用技术得到加快发展。如液相色谱与质谱联用(HPLC-MS)使 HPLC对复杂基体化合物的高分离能力与MS独特的选择性、灵敏度、分子量及结构信息相结合,广泛用于生物碱的定性定量分析研究。李丽梅等[35]运用 HPLC-MSn技术,从白背三七叶片的生物碱提取物中检测出2个肝毒性吡咯里西啶生物碱。气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术具有样品用量少、定性准确和不易丢失组分等优点。郭志峰等[36]采用气相色谱-质谱联用方法,对中草药青风藤中的生物碱进行分析,鉴定出青藤碱等生物碱。由于毛细管电泳(CE)和质谱(MS)的快速发展以及CE-MS接口的日趋成熟,在天然产物研究领域CE-MS应用越来越广泛。

生物碱作为中草药中具有生理和药理活性的重要组分,各种生物碱独特效能的不断发掘及其广泛应用极有可能成为我国将来具有自主知识产权的新药,其提取、分离纯化和鉴定技术的研究将日趋活跃。

[1]南京大学化学系有机化学教研室.有机化学(下册)[M].北京:高等教育出版社,1988.

[2]常福厚,刘素珍.麻黄碱类药物构效关系初探[J].内蒙古医学院学报,1997,19(1):36-39.

[3]张清德,綦聚鳌.麻黄生物碱的衍生物与应用[J].中国药学杂志,1992,27(3):134-138.

[4]回瑞华,侯冬岩,李铁纯,等.绿茶化学成分的研究[J].鞍山师范学院学报,2002,4(1):54-57.

[5]李耀武,周有骏,朱驹,等.粟亚男秋水仙碱位点抑制剂的结构特征研究[J].药学实践杂志,2007,25(6):372-375.

[6]何红平,刘复初.秋水仙碱类化学成分的研究概况[J].天然产物研究与开发,2000,12(2):87-94.

[7]何纯莲,任凤莲,吴泓毅,等.百合中秋水仙碱的分离及结构表征[J].中南大学学报(自然科学版),2006,37(2):286 -289.

[8]唐传核.植物生物活性物质[M].北京:化学工业出版社,2005.

[9]吴立军.天然药化学(第四版)[M].北京:人民卫生出版社,2003.

[10]杨秀伟.生物碱(实用天然产物手册丛书)[M].北京:化学工业出版社,2005.

[11]陈友梅.中药化学[M].济南:山东科学技术出版社,1988.

[12]哈成勇,沈敏敏,刘治孟.天然产物化学与应用[M].北京:化学工业出版社,2003.

[13]匡海学.中药化学[M].北京:中国中医药出版社,2003.

[14]欧晓明,唐德秀.分子分类学和化学分类学在农药创制中的作用[J].世界农药,2003,25(3):1-4.

[15]陈晓青,蒋新宇,刘佳佳.中草药成分分离分析技术与方法[M].北京:化学工业出版社,2006.

[16]徐任生.天然药物化学(第2版)[M].北京:科学出版社,1993.

[17]肖桂青,田云,卢向阳,等.微波辅助提取荷叶生物碱条件的优化[J].氨基酸和生物资源,2007,29(2):76-79.

[18]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2005.

[19]杨长府,焦云飞.烟叶中烟碱含量的非水滴定[J].分析化学,1997,25(3):368.

[20]赵红侠,尹德忠.电位滴定法测定近视乐滴眼液中总生物碱[J].理化检验(化学分册),2009,45(4):440-445.

[21]崔盛,陈蕤,陶宗娅,等.分光光度法测定川产乌头属植物总生物碱的含量[J].四川师范大学学报(自然科学版), 2007,30(5):642-646.

[22]王家俊.FT-NIR光谱分析技术测定烟草中总氮、总糖和烟碱[J].光谱实验室,2003,20(2):181-185.

[23]陈怀侠,韩凤梅,杜鹏,等.苦参生物碱电喷雾质谱分析[J].分析化学,2006,34(2):205-208.

[24]陈焕文,郑健,王伟萍,等.电喷雾解吸电离质谱快速测定吴茱萸中生物碱[J].分析化学,2009,37(2):237-241.

[25]胡明华,胡昌奇,侯喜林.安徽小檗生物碱成分的研究[J].天然产物研究与开发,2008,20(4):633-635.

[26]李宁,张鹏,梁东,等.7-氧代阿朴菲型生物碱的NMR研究[J].波谱学杂志,2009,26(3):400-407.

[27]刘正聪,陆舍铭,刘春波,等.超高效液相色谱法测定卷烟生物碱向主流烟气的迁移率[J].光谱实验室,2009,26 (2):357-361.

[28]高志强,邓小华,周清明,等.湖南烤烟生物碱含量及其相关性分析[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2008,34 (3):288-292.

[29]凌育赵.TLC-UV分析测定南昆山白毛茶生物碱成分[J].农业与技术,2005,25(2):83-87.

[30]梁宝钻,李菁,梁卫萍,等.亚东乌头总生物碱的超临界二氧化碳萃取及含量测定[J].中药材,2002,25(5):332 -333.

[31]张兰,陈国南,方禹之.毛细管电泳-电化学检测法用于生物碱电离常数线性模型的研究[J].化学学报,2004,62 (10):975-978.

[32]宋冠群,董文举,林金明,等.茶叶指纹谱的毛细管胶束电动色谱法研究[J].色谱,2003,21(4):359-362.

[33]董襄朝,王薇,王海波,等.麻黄碱印迹聚合物合成条件对其形态及结合特性的影响[J].色谱,2005,23(1):7-11.

[34]林秋明,何建峰,刘岚,等.异戊巴比妥分子印迹聚合物的合成和识别性能研究[J].分析测试学报,2004,23(3):43 -45.

[35]李丽梅,张涵庆,吕寒,等.白背三七叶中吡咯里西啶生物碱的LC-MSn检测[J].植物资源与环境学报,2008,17 (2):79-80.

[36]郭志峰,郭婷婷,马瑞欣.气-质联用分析青风藤中的生物碱[J].河北大学学报(自然科学版),2007,27(1):50 -53.

Progress on the Method of Classification and Identifying of Alkaloids

ZHANG De-hua1,2,LI Ru1,W ANG Yong-mei1,ZHU Xiao-yun1,W ANG Yan-yan1
(1.College of Biological and Pharmaceutical Engineering,West A nhui University,L u’an237012,China;
2.Plant Biotechnology Training Center of A nhui Province,L u’an237012,China)

Alkaloids are alkaline nitrogenous organic compounds,which are widely existed in the natural plant.Most of alkaloids have significantly physiological activity,which are the effective ingredients in many medicinal plants.The application and development of different methods for Classification and identifying of alkaloids in recent years were reviewed in this paper.

alkaloids;classification;identifying;progress

Q946.88

A

1009-9735(2010)05-0069-05

2010-05-24

安徽省高校省级自然科学基金重点项目(KJ2008A15ZC)。

张德华(1957-),男,安徽六安人,教授,研究方向:天然产物开发。