一种优良半矮秆水稻品种的分离与分子鉴定＊

林建中，杨远柱，赵小英，唐冬英，周 波，杜长青，刘选明†

（1.湖南大学 生物学院，化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南 长沙 410082；2.湖南亚华种业科学研究院，湖南 长沙 410001）

矮秆或半矮秆性状是包括水稻（OryzasativaL.）在内的禾谷类作物的重要性状之一.矮秆或半矮秆作物不仅提高抗倒伏能力，而且不影响穗的育性和结实率，从而提高了作物产量[1].众所周知的导致粮食产量大幅提高的“绿色革命”就是由于培育和大规模推广高产的半矮秆水稻品种所带来的一场作物绿色革命.

赤霉素（gibberellin，GA）在调节植物的许多生理过程，如种子萌发、茎的伸长、花和果实的发育等方面起着非常重要的作用[2－4].迄今为止，从水稻分离的与赤霉素有关的突变体被归为3类：细长型突变体、GA非敏感型突变体和GA敏感型突变体[5－6].细长型突变体表现出一种组成型的持续激活的GA响应模式，而矮秆突变体则出现GA生物合成途径或信号转导途径的缺失.如细长型水稻突变体slr1－1是由一个隐性单基因控制，并导致组成型的GA敏感表型[7].隐性的GA非敏感型矮秆突变体d1是由于其异源三聚体G蛋白的α－亚单位突变，导致GTP结合蛋白无法传递赤霉素信号，使GA不能正常发挥作用，从而导致极端矮秆性状，而且外源GA处理不能使茎伸长[8].同时，Ueguchi－Tanaka等[8]在水稻中鉴定了一种赤霉素不敏感的矮化突变体gid1，而GID1过量表达则会导致对赤霉素超敏感.这些研究结果表明，赤霉素信号转导途径受阻使得赤霉素对植株生长发育的调节得不到有效执行，从而导致植株矮化.

在水稻中，许多GA敏感型矮秆突变体及其相应基因已经被分离和鉴定.如突变体dx和d18分别为内根－贝壳杉烯氧化酶和GA3氧化酶发生突变，导致体内活性GA1的含量降低[9－10].半矮秆突变体sd－1是由于 GA20氧化酶－2基因 （Os－GA20ox－2）突变导致 GA20氧化酶－2活性丧失，体内活性GA1的含量降低[11－13].该突变性状增加了抗倒伏能力和产量，广泛应用于水稻育种，被誉为“绿色革命”.另一个 GA20氧化酶基因（Os－GA20ox－1）也已被分离和克隆，发现特异性抑制该基因表达可以导致矮化[14].另外，一个Ds标记的水稻敏感型矮秆突变体已被分离，发现是由于GA合成的第二步催化过程中的内根－贝壳杉烯合成酶（KS）被破坏所致[15].这些结果表明，赤霉素敏感型矮秆突变体是由于赤霉素生物合成途径中某一关键酶的活性降低或丧失，从而阻碍了赤霉素的生物合成和代谢，导致内源GA含量显著降低.因此，该突变类型亦称GA缺陷型矮秆突变体.该类绝大部分突变体呈现明显的矮化，外施GA可恢复其正常表型.

株1S是一种中国南方杂交水稻育种广泛应用的优良两系光温敏雄性核不育系[16].它具有育性转换临界温度低、高抗逆性和广亲和性等特点.但是其株高偏高，抗倒伏能力差，容易导致杂交后代因倒伏而减产.为了改良该农艺性状，采用无性系诱变育种方法选育了优良矮化突变株系SV1S和SV14S[17].本研究中，我们从形态、生理和分子水平对矮化突变株系SV1S和SV14S进行了研究，以期阐明SV突变株系矮化的原因.

1 材料与方法

1.1 实验材料

株1S为湖南省株州市农科所培育的籼型光温敏核不育水稻，SV1S和SV14S为本研究组利用体细胞无性系变异筛选的半矮秆突变体.另外，2个粳稻品种日本晴和黄壳糯在Southern杂交实验中用作对照.

1.2 实验方法

1.2.1 半矮秆突变体的分离

从株1S中分离2～3cm长的幼穗，经表面消毒后接种于 MS＋2，4－D 2.0mg／L培养基中诱导愈伤组织.3周后将诱导的愈伤组织转移至 MS＋6－BA 0.2mg／L＋2，4－D 2.0mg／L继代培养.4周后将继代培养后的胚性愈伤组织转接至 MS＋2，4－D4.0mg／L培养3周左右，然后转移至 MS＋6－BA 2.0mg／L诱导芽的分化.分化苗再转移至MS＋NAA 0.5mg／L＋IAA 0.5mg／L进行生根培养2周，待根长好后炼苗1周，最后移栽至大田中.所有组织培养条件为16h光照和8h黑暗，温度为（25±2）℃.分化苗（R0）移栽至大田中，抽穗期套袋自花受粉，成熟期单株收种.体细胞无性系突变体（SV）表型的初步鉴定按文献[17]的方法在R1和R2代进行.

1.2.2 半矮秆突变体表型的鉴定

SV突变体的表型鉴定于R2代进行.由于不育状态的不育系水稻有旗叶鞘包穗现象，对植株高度的测量影响很大[18－19].因此，SV突变体及其亲本株1S都必需经低温处理恢复育性后方能测量株高和节间长度.SV突变体及其亲本株1S于冬季种植于海南陵水育种基地，利用低温（20℃左右）恢复育性，于成熟期测量株高及各节间长度.

茎的组织解剖学观察按照张全芳等[20]的方法进行.于抽穗期分别取株1S和SV14S的第IV节间进行石蜡切片，然后于奥林巴斯光学显微镜下观察并照相.

1.2.3 外源GA3对幼苗伸长的影响

将种子用0.1%的HgCl2消毒5～6min，蒸馏水冲洗3次后15℃下再浸种24h，放入光照培养箱中35℃催芽24h.等种子露白后再播于盛有蛭石的瓷盘中，30℃培养3d后，分别以7种不同浓度（1×10－10mol／L，1×10－9mol／L，1×10－8mol／L，1×10－7mol／L，1×10－6mol／L，1×10－5mol／L，1×10－4mol／L）的GA3溶液每天浇苗的基部，并以清水浇苗的基部作为对照，直至第一叶停止生长为止，比较播后第6d的第二叶鞘长度.每种材料各个浓度测量40株，去掉最高和最矮苗后，测量38株苗的第二叶鞘长度.另外，测量播种后第7d的幼苗高度.同样是每种材料各个浓度测量40株，去掉最高和最矮苗后，测量38株苗的高度.

1.2.4 外源GA3对无胚半粒种子α－淀粉酶的诱导

参照 Ueguchi－Tanaka等[8]的方法准备无胚半粒种子和α－淀粉酶的诱导.首先配制0.2%淀粉－2%琼脂培养基，高压蒸汽灭菌.灭菌后，待培养基冷却至60℃左右，于超净工作台上在部分培养基中加入GA3，至终浓度为10－6mol／L.然后将含GA3和不含GA3培养基分别倒入灭菌培养皿中，冷却后备用.挑选饱满水稻种子，去掉颖壳，用70%的酒精灭菌1～2min，0.1%的 HgCl2浸泡10～15 min，再用无菌水冲洗5次，在无菌条件下将种子切成两段，挑取无胚半粒段分别均匀地置入含GA3和不含GA3培养基的培养皿平板中，每培养皿放置6粒种子.30℃培养4d后，加I－KI指示剂到培养皿中，2～3min后倾出I－KI指示剂，用蒸馏水冲洗琼脂表面，然后观察种子周围出现的透明圈，并测量透明圈的大小.每种材料在不同培养基上共处理30粒种子，即5个培养皿平板.

1.2.5 RFLP分析

采 用 CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）法[21]提取叶片基因组DNA.参照 Motoyuki等[22]的方法进行限制性片段长度多态性[Restriction fragment length polymorphism （RFLP）]分析.基因组DNA（20μg）经限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切过夜后，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，再转移至尼龙膜上.按照Spielmeyer等[12]的方法采 用 正 向 引物 （5’－GCGCCAATGGGGTAATTAAAACG－3’）和反向引物（5’－GGCATTCCATTGTTTGTGATTGG－3’）从GA20ox－2 基 因 中 扩增的634bp片段作为杂交用的探针.探针采用α－32P－ATP标 记.在 0.25mol／L Na2HPO4，1.0 mmol／L EDTA和7%SDS溶液中于65℃杂交过夜.在2×SSC，0.1%SDS溶液中于65℃洗膜15 min，共洗膜2次，然后再于0.2×SSC，0.1%SDS溶液中于65℃洗膜15min.

1.2.6 序列分析

已有研究表明，GA20ox－2 基因（GenBank accession no.AY114310）有3个外显子和2个内含子，定位于1号染色体上[11－13].为了得到GA20ox－2的旁邻序列，以GA20ox－2的序列在基因组数据库中进行了BLAST搜索，结果在粳稻品种日本晴基因组数据库中搜索到人工细菌染色体（BAC）克隆AP003561（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／entrez／viewer.fcgi？db＝nuccore＆id＝16191728）以及籼稻品种9311基因组数据库中搜索到scalffold000946（http：／／rise.genomics.org.cn／rice／jsp／report／scaffReport.jsp？scaffold＿id＝3550＆organism＝9311）与GA20ox－2的序列相匹配.然后以软件Primer Premier 5.0分析GA20ox－2基因及其旁邻序列的HindIII和EcoRI的酶切位点.

1.2.7GA20ox－2的表达分析

采用Trizon RNA提取试剂盒（Invitrogen）从叶片中提取总RNA.首先采用半定量RT－PCR分析GA20氧化酶基因的转录水平.GA20ox－1（GenBank acces－sion no.U50333）的半定量RT－PCR引物序列为：正向引物（F）为5’－CGTCACCTGCAACCAACAAT－3’；反向引物（R）为5’－GATGGGTACGTGCAAACCAA－3’.GA20ox－2（GenBank accession no.AY114310）的半定量RT－PCR引物序列为：正向引物（F）为5’－TACTACAGGGAGTTCTTCGCGGACAGCA－3’；反向引物（R） 为 5’－TGTGCAGGCAGCTCTTATACCTCCCGTT－3’.作为内参的水稻肌动蛋白基因Actin（GenBank accession no.X16280）的半定量RT－PCR引物序列为：正向引物（F）为5’－CTGGGTTCGCCGGAGATGAT－3’；反向引物 （R）为 5’－TGAGATCACGCCCAGCAAGG－3’.

随后采用荧光定量PCR（QPCR）进一步验证GA20氧化酶基因的转录水平.QPCR在MX3000荧光定量PCR仪上进行，以染料ROX作为参比荧光强度，具体操作步骤见 Costa等[23]的方法.GA20ox－2的QPCR引物与半定量RT－PCR一样，但是GA20ox－1和Actin基因的QPCR引物作了相应改变.GA20ox－1的QPCR引物序列为：正向引物（F）为5’－AATGAGCATGGTGGTGCAGCAGGAGCAG－3’；反向引物 （R）为 5’－GTTAACCACCAGGAAGAAGCCGTGCCTC－3’.Actin的QPCR引物序列为：正向引物（F）为5’－AGTCTGACCCATCCATTGTGC－3’；反向引物（R）为5’－TTGTCCACGCTAATCAAGAAAC－3’.值得说明的是，所有引物都设计在相应基因cDNA的3’端.

2 结果与分析

2.1 矮秆突变体的分离和表型分析

株1S植株偏高，节间较长，其杂交后代抗倒伏性较差.已有研究表明[24]，在植物组织培养中，体细胞容易产生突变，所以采用体细胞无性系诱变方法筛选半矮秆突变体，以期降低株1S的高度.通过约2～3个月的愈伤组织诱导、继代和分化，得到了24个具有明显不同于亲本株1S的独立分化植株（R0）.在 R1代发现2个突变株系SV1S和SV14S表现出半矮秆性状，并且其他农艺性状仍然比较优良.经过R2和R3代的后续表型分析发现，2个SV突变株系的半矮秆性状没有出现分离，说明通过体细胞诱变的方法成功获得了性状稳定的半矮秆突变体.除了植株高度变矮之外，SV1S和SV14S的表型与亲本株1S基本没有差异（图1）.更重要的是，突变体仍然保留了株1S的优良性状，包括光温敏不育的生理特性（数据未列出）.

图1显示了亲本株1S和SV突变体的植株形态和高度.从图可知，植株高度按株1S，SV14S和SV1S的顺序从78.5cm逐渐降低为60.3cm.同时分析了株1S和SV14S的各节间长度，结果发现与亲本株1S相比，SV14S的基部节间长度明显缩短，而上部节间几乎没有变化（图2（a）和（b））.该性状不仅提高了抗倒伏能力，而且有助于产量的增加.另外，进一步观察了位于基部的IV节间横切面，发现SV14S节间直径和节间壁厚度均显著大于亲本株1S（图2（c））.结果说明，突变体SV14S增加了抗倒伏能力，有助于提高产量.

图1 SV突变体的表型.SV突变体和株1S经低温（20°C）处理后恢复育性，于成熟期测量植株高度.Fig.1 Phenotype of theSVmutants.The parent Zhu1Swas used as control.All mutants and Zhu1S restored the fertility after treatment with low temperature（20 ℃）and the height of plants were measured at the ripening stage

2.2 SV突变体对外源GA表现出正常的敏感性

赤霉素的一个重要生理功能是促进水稻苗的生长[25－26].为了确定所获得的半矮秆突变体是否与GA有关，我们检测了其GA敏感性特征.在缺乏外源赤霉素时SV突变体的幼苗和亲本株1S高度几乎相同，而施加外源GA3时SV突变体的幼苗却比对照亲本高（图3（a））.结果表明，SV1S和SV14S幼苗对外源赤霉素表现出正常的敏感性.同时，还研究了外源GA3对第二叶鞘长度的影响，发现SV突变体和亲本株1S的第二叶鞘均对不同浓度GA3敏感，其伸长程度都非常相似（图3（b））.该结果进一步证明，SV突变体在叶鞘的生长方面也对GA敏感.

图2 SV14S和株1S各节间的比较.（a）和（b）SV14S基部节间（图右）明显缩短.Ⅰ－Ⅳ，分别表示自穗而下的各节间.标尺，5cm.（c）株1S（图上）和SV14S（图下）Ⅳ节间的横切面的显微观察.标尺，1mm.SV14S和株1S经低温（20℃）处理后恢复育性，于成熟期进行检测Fig.2 Comparison of the internodes ofSV14Sand Zhu1S.（a）and（b）Typical compaction of lower internodes inSV14Splants（right）.Ⅰ－Ⅳ，the respective internodes from top to bottom.Scale bar，5cm.（c）Anatomical observation of the transverse section of theⅣinternodes of Zhu1S（above）andSV14S（low）.Scale bar，1mm.BothSV14Sand Zhu1Srestored the fertility after treatment of low temperature（20 ℃）and the observation were performed at the ripening stage

另外，还研究了外源赤霉素对无胚半粒种子α－淀粉酶的诱导特性（图3（c））.研究发现，在含GA3的淀粉平板中SV突变体和亲本株1S的无胚半粒种子周围均产生了明显的晕圈，说明都有α－淀粉酶诱导.但是在不含GA3的淀粉平板中SV突变体和株1S都没有产生晕圈.该结果表明SV突变体和亲本株1S无胚半粒种子的α－淀粉酶都能被外源GA3诱导，进一步证明了SV突变体对外源赤霉素敏感，其半矮秆性状可能是由于活性GA的缺失引起的.然而与亲本株1S相比，SV突变体的晕斑数目较少，晕斑的大小也较小，说明在组织培养过程中SV突变体中可能还有其他与赤霉素合成无关的基因产生了突变，从而导致在GA敏感性和植株高度方面产生了微小差异.综合以上生理研究结果可以得知，SV1S和SV14S矮化性状不是由于赤霉素信号转导途径缺失引起的，很可能是由于赤霉素生物合成途径的缺失或其他突变导致的.

图3 SV突变体对外源GA3的反应（a）GA3处理对株1S（◆），SV1S（■）和SV14S（▲）幼苗伸长的影响.M mol／L.（b）GA3处理对株1S（◆）V1S（■）和SV14S（▲）第二叶鞘伸长的影响.M mol／L.（c）无胚半粒种子的α－淀粉酶的诱导.Zhu1S和SV突变体的无胚半粒种子置于含有10－6mol／L GA3（＋）和不含GA3的淀粉平板上.淀粉用碘染色检测.Fig.3 Response of theSVmuants to exogenous GA3（a）Elongation of the seedlings in reponse to GA3 treatment.Zhu1S（◆），SV1S（■）andSV14S（▲）.M mol／L.（b）Elongation of the second leaf sheath in reponse to GA3treatment.Zhu1S（◆），SV1S（■）andSV14S（▲）.M mol／L.（c）α－amylase induction in embryoless half seeds.Embryoless half seeds from Zhu1SandSVmutants were placed on starch plates with（＋）or without（－）10－6mol／L GA3.Starch was detected by staining with iodine

2.3 SV突变体的GA20ox－2基因中的一段缺失引起该基因的表达量降低

鉴于本研究中SV突变体的表型与已知sd－1突变体非常类似，所以我们采用Spiel Meyer等[12]的限制性片段长度多态性（RFLP）方法首先研究了SV突变体的GA20ox－2基因.采用PCR方法从亲本株1S的GA20ox－2中克隆了一段长634bp片段作为探针.在RFLP杂交图谱中，SV突变体和亲本株1S间有明显的谱带差异（图4（a）和（b））.当基因组DNA以限制性内切酶HindIII酶切后，亲本株1S杂交条带出现在约4.4kb位置，而SV突变体杂交条带小约200bp，出现在4.2kb位置（图4（a））.该结果表明在SV突变体GA20ox－2中存在一个约200bp片段的缺失.另外还发现，2个野生型粳稻品种日本晴和黄壳糯的杂交条带出现在4.6 kb位置，比籼稻品种株1S杂交条带大200bp左右.该结果意味着在籼稻和粳稻GA20ox－2区域间存在约200bp的差异.当基因组DNA以EcoRI酶切后，在野生型对照品种株1S、日本晴和黄壳糯中均出现2条分别为2.3kb和1.1kb杂交条带，但是在SV突变体中仅出现一条约3.1kb杂交条带（图4（b））.这些结果表明在SV突变体GA20ox－2中存在一段约200bp的缺失，并导致GA20ox－2中的一个EcoRI酶切位点消失.同时，在基因组中也检测到了另外一个GA20氧化酶基因.在RFLP的杂交图谱中，杂交信号比较弱的条带（8kb，图4（a）；23kb，图4（b））可能就是另一个定位在3号染色体上的GA20氧化酶基因（GA20ox－1；GeneBank accession no.U50333）[14].

图4 Southern blot分析.（a）HindIII酶切的基因组DNA.（b）EcoRI酶切的基因组DNA.从株1S基因组DNA中扩增来的GA20ox－2的外显子2用α－32P－ATP标记作为探针.粳稻品种黄壳糯（H）和日本晴（N）以及亲本株1S（Z）用作对照.1，SV1S；14，SV14S.（c）在scalffold000946中的GA20ox－2基因及其旁邻区域的EcoRI和HindIII的酶切图谱分析.外显子用黑框表示，内含子和5’，3’端的非编码区用线条表示.粗线段代表探针.每个限制性内切酶上方的数字代表相应的酶切位点.位点39371＊显示粳稻和籼稻间本就有的237bp的缺失差异.Fig.4 Southern blot analysis.（a）HindIII－digested genomic DNA.（b）EcoRI－digested genomic DNA.The exon2ofGA20ox－2amplified from genomic DNA of Zhu1Swas used as the probe and labeled withα－32P－ATP.Thejaponicalvarieties，Huangkenuo（H）and Nipponbare（N），and the parent Zhu1S（Z）were used as the contol.SV1S（1）andSV14S（14）.（c）Schematic diagram of theEcoRI andHindIII restriction map around the region ofGA20ox－2gene in scalffold000946.Exons are shown as black boxes；introns and the non－coding region of 5’and 3’terminal are shown as lines.The thick line represents the probe.The numbers on the each restriction enzyme represent the corresponding positions.The site 39371＊shows the original 237bp deletion inindicarice compared withjaponicaones.

为了进一步验证以上RFLP结果的可靠性，对粳稻和籼稻GA20ox－2及其旁邻序列的HindIII和EcoRI酶切位点进行了分析.图4（c）显示了GA20ox－2区域EcoRI和HindIII酶切位点的限制性图谱.基于限制性图谱和所用探针序列的分析，在HindIII酶切的杂交图谱中预计会出现有4412 bp杂交带，而在EcoRI酶切的杂交图谱中会出现2条分别为2376bp和1105bp杂交带.正如上面所描述的一样，亲本株1S的RFLP研究结果与预期结果完全一致，而SV突变体RFLP结果与预期结果不同.实际上，通过来自籼稻品种9311的scalffold000946和来自粳稻品种日本晴的BAC克隆AP003561的序列分析发现，在scalffold000946的39371位点有一个237bp片段的缺失，位于GA20ox－2 5’端的非编码区.这个在籼稻和粳稻间固有的差异导致在HindIII酶切RFLP杂交图谱中，株1S的杂交条带比粳稻品种日本晴和黄壳糯小约200bp.所以这个籼稻和粳稻间固有的237bp差异可以作为阳性对照，从而推知与亲本株1S相比较SV突变体GA20ox－2中存在一个约200bp的缺失突变.基于以上结果推知，在2个SV突变体GA20ox－2中存在约200bp的缺失突变，导致GA20ox－2中4316位点的EcoRI酶切位点消失.根据Ashikari等人[27]的报道，已有4个sd－1等位基因被分离和鉴定出来.一个来源于低脚乌尖和IR8的sd－1等位基因存在一个383bp片段缺失，导致了移码突变而提前产生了终止密码子.其他3个分别来源于Jikkoku，Reimei和Calrose 76的sd－1等位基因均分别在不同位点出现了点突变，从而造成了一个氨基酸的改变.在本研究中，SV突变体GA20ox－2中出现了约200bp缺失突变，该突变不同于已报道的4个sd－1等位基因，说明该突变基因是一个新的sd－1等位基因.

另外，还分析了GA20氧化酶基因GA20ox－1和GA20ox－2在亲本株1S和SV突变体间的表达差异（图5）.首先通过半定量RT－PCR分析，结果发现GA20ox－1在株1S，SV1S和SV14S中都有很高的表达量，而在亲本株1S和突变体SV1S，SV14S间却没有明显差异.相反，GA20ox－2在突变体SV1S和SV14S中表达量很低，而在亲本株1S中表达量较高.随后QPCR分析也得到了同样的结果，进一步证实了GA20ox－2在亲本和突变体SV1S，SV14S间的表达差异性（图5（b），（c））.综合以上结果，我们认为SV突变体GA20ox－2的缺失突变造成了该基因表达量的降低，使植株体内活性赤霉素含量减少而导致矮秆性状.

图5 在SV突变体和株1S中GA20ox的表达分析.（a）GA20ox－1（U50333）和GA20ox－2（AY114310）的半定量 RT－PCR分析.（b）GA20ox－1的定量PCR分析.GA20ox－2的定量PCR分析.肌动蛋白基因（X16280）由来为对照.Fig.5 Expression analysis ofGA20oxgene inSVmuants and Zhu1S.（a）Semi－quantitative RT－PCR analysis ofGA20ox－1（U50333）andGA20ox－2（AY114310）.（b）Quantitative real time PCR analysis ofGA20ox－1.（c）Quantitative real time PCR analysis ofGA20ox－2.Actin gene（X16280）was used as a control.

3 讨 论

体细胞无性系诱变经常在生产中用于改良作物品种.本研究获得的2个突变体具有不同的半矮秆表型，其中SV14S保留了亲本株1S的大多数优良农艺性状[17]，表明SV14S是一个理想的半矮秆光温敏不育系，将来在水稻杂交育种中很有可能取代亲本株1S，具有很高的应用价值.该优良突变体的成功诱变和筛选充分说明了体细胞无性系诱变具有比较温和的突变特性，能够用于改良在生产中具有很高品质和商业价值但是又具有某种不良性状的水稻品种，从而培育出更为优良的新品种.

迄今为止，在水稻中已经有超过60个矮秆突变体被分离和鉴定出来，并且把它们归为赤霉素缺陷型矮秆突变体、赤霉素非敏感型矮秆突变体和其他原因造成的矮秆突变体[29].例如，突变体dx，d18和sd－1是赤霉素合成途径的缺陷导致活性赤霉素GA1含量降低而造成矮秆[9－10].突变体d1和gid1在赤霉素信号转导途径中出现缺陷而导致对赤霉素表现出不敏感而造成矮秆[8].突变体d61和d2已分别被确认为是在油菜素内酯（BR）信号受体和油菜素内酯生物合成途径的基因发生突变而导致矮秆性状[8，27].

赤霉素GA20氧化酶是赤霉素生物合成途径中的一个关键酶，它催化一系列的氧化反应并消除C－20，为催化GA合成途径最后一步反应的酶GAβ－羟基化酶（GA3ox）提供底物[30].在水稻中，编码GA20氧化酶的2个基因GA20ox－1和GA20ox－2已经被鉴定出来.其中特异性抑制GA20ox－1的表达会导致植株高度的矮化[9，14].更重要的是，被誉为“绿色革命基因”的GA20ox－2功能的缺失而造成的sd－1矮秆突变体也被分离和鉴定出来[11－13].迄今为止，已有4个sd－1的等位基因被分离和鉴定.一个来源于低脚乌尖和IR8的sd－1等位基因存在一个383bp片段的缺失，导致了移码突变而提前产生了终止密码子.其他3个分别来源于Jikkoku，Reimei和Calrose 76的sd－1等位基因均分别在不同位点出现了点突变，从而造成了一个氨基酸的改变，导致所编码的GA20氧化酶部分功能的缺失.在本研究中，SV突变体GA20ox－2基因中出现了约200bp缺失突变，该突变不同于已报道的4个sd－1等位基因，说明该突变基因是一个新的sd－1等位基因.

植株高度，特别是半矮秆性状，经常被认为是一个数量性状并受到多种遗传因素的影响.在研究中，发现2个SV突变体在GA20ox－2基因中都存在约200bp缺失，说明2个突变体最初来源于组织培养中的同一个突变细胞.然而，2个突变株系在植株高度和α－淀粉酶对外源赤霉素敏感性方面又存在差异，这意味着在愈伤组织的继代、分化和突变株的分离筛选过程中2个突变株系间还有另外一个微效基因发生了突变.

与亲本株1S相比，尽管SV突变体在GA20ox－2基因中出现了约200bp缺失突变，导致该基因表达量降低，而且在成熟期表现出明显的半矮秆性状.但是，在幼苗期当缺乏外源赤霉素时，亲本株1S和SV突变体都具有相同的植株高度，而且SV突变体在水稻种子糊粉层α－淀粉酶的诱导实验中还表现出了对外源赤霉素敏感性的降低.这些生理性状均与已报道的sd－1突变体有所不同[11－13].因此，我们猜想在SV突变体中还存在另一个突变位点，使得SV突变体与所报道的sd－1突变体有所差异.目前，我们从SV14S与一个高秆籼稻恢复系ZR02的杂交后代中筛选到了一个新型半矮秆光温敏雄性不育系湘陵628S.该品种已经通过了湖南省品种审定，被确认为超级杂交早稻的优良母本.与我们所预期的结果一样，湘陵628S株高72cm左右，并且发现在该突变体中因为杂交而丢失了GA20ox－2突变位点，恢复为正常GA20ox－2，从而使得其株高高于母本SV14S，而矮于“祖母”株1S.这进一步证实了可能存在的另一个突变位点造成了湘陵628S的株高与其母本SV14S和“祖母”株1S间的差异.当前，我们正在对湘陵628S中的突变位点进行图谱定位和克隆，以期进一步了解该突变株系的矮秆突变分子机制.

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