VEGF及EGFR在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

宋懿懿 顾爱琴 韩宝惠 张少俊

1.上海交通大学附属胸科医院呼吸内科 ，上海 200030；2.上海交通大学研究生院医学院分院，上海 200025；3.上海同济大学附属肺科医院结核科，上海 200433

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种重要的血管生成调控因子，其与受体结合后会导致血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移，促进肿瘤新生血管形成，其过度表达往往与肿瘤细胞的生长活跃程度密切相关［1］。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是Ⅰ型酪氨酸激酶受体基因家族成员之一，酪氨酸激酶受体RTKs是细胞膜表面的一种蛋白，主要参与细胞的信号转导，一旦被激活就会导致细胞的分化、增殖、浸润和血管发生［2］。近年来研究发现，EGFR与70%以上的恶性肿瘤有关，在NSCLC、乳腺癌、前列腺癌和胃肠道肿瘤组织中均有EGFR的过度表达。Byers等［3］将VEGF和EGFR作为NSCLC的重要治疗靶点，通过抑制两者，可以明显阻止肿瘤细胞的生长和转移。本研究应用免疫组织化学方法观察NSCLC肿瘤组织中VEGF和EGFR的表达，分析两者的相关性，并探讨两者表达水平与NSCLC临床、病理特征以及预后的关系。

1 资料和方法

1.1 标本来源 收集本院2003年11月—2004年12月间手术切除的，术后病理诊断确诊为NSCLC的存档石蜡组织标本186例。所有患者术前均未接受化疗、放疗或其他抗癌治疗。186例患者，年龄25～70岁，平均年龄（51±10）岁；男性123例，女性63例；其中非吸烟患者70例，吸烟患者116例；鳞癌111例，腺癌75例；中央型肺癌97例，周围型肺癌89例；中、高分化者148例，低分化者38例；有淋巴结转移的114例，无淋巴结转移的72例；生存时间<3年的75例，≥3年的111例，生存时间<5年的119例，≥5年的67例。TNM分期根据1997年国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行，其中Ⅰ～Ⅱ期106例， Ⅲ～Ⅳ期80例。全部病例采取电话或信件随访方式，随访截止日期到2009年12月31日。

1.2 试剂 Dako REALTMEnVisionTM为Dako公司产品，人抗VEGF和EGFR单克隆抗体（浓缩型1∶50稀释），poly-L-lysine多聚赖氨酸（GLV-0040），trypsin胰蛋白酶，显色剂DAB Kit均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 检测方法 采用EnVision法，首先用poly-L-lysine 处理载玻片，连续石蜡切片4 μm，60 ℃烘干处理1 h，常规脱蜡、水化组织切片；pH=6.0的柠檬酸修复液修复VEGF抗原，胰蛋白酶消化、修复处理EGFR抗原；切片用蒸馏水冲洗1次（每次3 min），PBS冲洗2次（每次3 min）；3%H2O2处理片子10 min，以抑制内源性过氧化物酶，再用PBS冲洗片子3次（每次3 min）；滴加一抗，置于湿盒内，4 ℃反应过夜；PBS冲洗片子3次（每次3 min），滴加EnVisionTM反应30 min，PBS冲洗片子3次（每次3 min）；DAB显色3～5 min；苏木精对比复染，中性树脂封固。

1.4 结果判断标准 阳性肿瘤细胞判定标准：VEGF主要表达于肿瘤细胞的细胞质中，EGFR主要表达于肿瘤细胞的细胞膜上，光学显微镜下细胞质或细胞膜有棕黄色颗粒且细胞形态结构清晰；细胞着色明显高于背景底色；棕黄色颗粒明确，定位性好，不向外扩散［4］。采用染色指数法计算阳性结果，综合考虑阳性细胞百分数和染色强度。阳性细胞数计分方法：0～5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%以上为4分；染色强度计分方法：肿瘤细胞不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。如在同一病变中存在不同评分标准的视野，则取最大值和最小值的平均值作为评分结果。上述2项之和即为该肿瘤细胞的染色指数评分，染色指数0～2分定义为阴性表达，3～7分定义为阳性表达。

1.5 统计处理 应用SPSS 13. 0统计软件进行统计分析，NSCLC组织中EGFR和VEGF的表达与患者临床病理特征之间的关系用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，配对资料采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 VEGF和EGFR蛋白的表达 VEGF主要表达于肿瘤细胞的细胞质中，阳性表达位于肿瘤细胞的细胞质或细胞膜上，呈棕黄色或棕褐色，阳性产物呈弥漫或散在的棕黄或褐色颗粒（图1A和图1B）。EGFR主要表达于肿瘤细胞的细胞膜上，阳性表达位于肿瘤细胞的细胞膜或细胞质中，呈棕黄色或棕褐色，阳性产物呈弥漫或散在的棕黄或褐色颗粒（图1C和图1D）。NSCLC组织中VEGF阳性表达率为35.48%（66/186），EGFR阳性表达率为55.91%（104/186）。

2.2 VEGF和EGFR表达与临床及病理特征的关系 VEGF阳性表达率在有无淋巴结转移分别为41.23%和26.39%，两者经比较，差异有统计学意义（P=0.039），而与患者的性别、年龄、是否吸烟、肿瘤病理类型、肿瘤生长部位、肿瘤分期（TNM分期）和肿瘤分化程度等，差异无统计学意义。EGFR阳性表达率在男性、吸烟和鳞癌患者中，明显低于女性、未吸烟和腺癌患者（P<0.05），在N1～N3、Ⅲ～Ⅳ期患者中明显高于N0、Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.05），而与患者的年龄、肿瘤生长部位和肿瘤分化程度等无相关性（表1）。

图1 NSCLC组织中VEGF及EGFR的表达Fig.1 Expression of VEGF(A-B) and EGFR(C-D) in NSCLC(DAB, ×200)

表1 VEGF和EGFR的表达与NSCLC患者临床、病理特征之间的关系Tab.1 Relationship between expression of VEGF and EGFR, and clinical pathological characteristics of NSCLC patients

2.3 VEGF及EGFR的表达与预后的关系VEGF表达阴性组患者3年生存期明显优于VEGF表达阳性组患者，两者差异具有统计学意义（P=0.021）。EGFR表达阴性组患者3年生存期亦优于EGFR表达阳性组患者，两者差异有统计学意义（P=0.033）。同样，VEGF表达阴性组患者5年生存期明显优于VEGF表达阳性组患者，两者差异有统计学意义（P=0.031）。EGFR表达阴性组患者5年生存期亦优于EGFR表达阳性组患者，两者差异有统计学意义（P=0.047，表2）。对VEGF表达阳性组和VEGF表达阴性组作Kaplan-Meier生存分析，进行Generalized Wilcoxon检验（P=0.012），VEGF蛋白表达对患者的生存率有显著的影响，VEGF表达阳性组患者的生存率明显小于VEGF表达阴性组患者（图2A）。同样，对EGFR表达阳性组和EGFR表达阴性组作Kaplan-Meier生存分析曲线，同样行Generalized Wilcoxon检验（P=0.009），EGFR蛋白表达对生存率有极显著影响，EGFR表达阳性组患者的生存率小于EGFR表达阴性组患者（图2B）。

2.4 NSCLC患者肿瘤组织中VEGF和EGFR表达的相关性 186例NSCLC患者中，VEGF、EGFR同时阳性表达的是44例，同时为阴性表达的60例，VEGF阳性表达而EGFR阴性表达者22例，VEGF阴性表达而EGFR阳性表达者60例。经Spearman等级相关分析显示，NSCLC组织中VEGF与EGFR的表达具有相关性（rs=0.161，P<0.05）。

3 讨 论

有文献报道原位杂交检测结果显示，VEGF mRNA主要分布在肿瘤细胞中，而肿瘤细胞外缺乏VEGF mRNA，提示VEGF是由肿瘤细胞产生的。VEGF的表达与NSCLC患者是否有淋巴结转移密切相关，VEGF表达阳性者，淋巴结转移明显增高［5］。多数研究显示［6］，VEGF的表达与NSCLC的预后有显著的相关性，高表达者预后较差。一般认为，在NSCLC中VEGF的表达与性别、年龄及肿瘤分期没有明显相关性。本研究186例NSCLC患者中，VEGF的阳性表达率为35.48%（66/186），其表达水平在有淋巴结转移的患者中明显高于无淋巴结转移者，两者比较，差异有统计学意义（P<0.05）；且VEGF表达阴性组患者3年和5年生存期明显优于VEGF表达阳性组患者，二者差异同样有统计学意义（P<0.05）；VEGF蛋白表达对生存率有显著影响，VEGF表达阳性组患者的生存率小于VEGF表达阴性组患者（P=0.012）。

表2 VEGF、EGFR的表达与NSCLC患者生存期的关系Tab.2 Relationship between expression of VEGF, EGFR and survival of NSCLC patients n(%)

图2 VEGF、EGFR在NSCLC组织中高表达的生存分析Fig.2 Survival analysis of expression of VEGF, EGFR in NSCLC tissues

EGFR的高表达可导致癌变，促进肿瘤细胞生长、侵袭、新生血管形成及远处转移［7］。最近国内外的研究发现［8］，EGFR在女性NSCLC患者中表达高于男性患者，可能与女性患者EGFR的基因突变高于男性有关。女性NSCLC患者中EGFR的表达与病理类型、TNM分期及是否有淋巴结转移有密切的关系，可作为判断女性NSCLC病情进展及预后的重要指标之一，还对其靶向治疗的选择有一定的指导意义。本研究结果证实上述结果，186例NSCLC患者中，EGFR的阳性表达率为55.91%（104/186），发现EGFR阳性表达率在男性、吸烟和鳞癌患者中明显低于女性、未吸烟和腺癌患者（P<0.05），在N1～N3、Ⅲ～Ⅳ期患者中明显高于N0、Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.05）；且EGFR表达阴性组患者3年和5年生存期优于EGFR表达阳性组患者，二者差异具有统计学意义（P<0.05）；EGFR蛋白表达对生存率有极显著影响，EGFR表达阳性组患者的生存率小于EGFR表达阴性组（P=0.009）。

VEGF和EGFR是恶性肿瘤细胞形成过程中的重要基因调控靶点，二者促进了肿瘤的发展并参与了肿瘤的浸润和转移［3］。本研究发现186例NSCLC患者VEGF和EGFR同时阳性表达者为44例，同时阴性表达者为60例，VEGF阳性表达而EGFR阴性表达者22例，VEGF阴性表达而EGFR阳性表达者60例，VEGF与EGFR在NSCLC组织中的表达具有相关性，这与赵学维等［9］报道的结论一致。可能由于癌基因EGFR的激活引起了细胞过度增殖，使细胞对氧的需求增加，从而促使VEGF表达上调。VEGF一方面通过旁分泌的方式作用于血管内皮细胞，与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成。另一方面，VEGF可能通过VEGF/NRP-1自分泌信号途径增强肿瘤自身的存活能力和侵袭活性。同时，VEGF可诱导抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，直接抑制肿瘤细胞的凋亡。在NSCLC的靶向治疗中，VEGF和EGFR是非常重要的靶点。ZD6474是一种口服的、小分子量的VEGFR酪氨酸激酶抑制剂，同时具有抑制EGFR酪氨酸激酶活性作用，既可以通过阻断VEGF活性而抑制肿瘤血管生成，又可以抑制肿瘤增生和存活。此外，EGFR抑制剂本身可以减低肿瘤组织表达VEGF及其他促血管生成因子，并可以抑制肿瘤内皮细胞上的EGFR，因此也表现出抗肿瘤血管生成的作用。Matsumori等［10］应用ZD6474，成功抑制了NSCLC模型肿瘤的生长。

总之，NSCLC组织中VEGF和EGFR存在过度表达，两者表达具有相关性；可作为判断NSCLC患者病情及预后的参考指标，也为肺癌患者采用个体化治疗提供新的依据。

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