使用优化PAGE电泳及银染技术检测临床粪便样品中的轮状病毒RNA

杨昭庆，黄永坤，刘馨

人轮状病毒肠炎是世界范围内的一个重要的健康问题，也是引起儿童腹泻并导致死亡的主要原因之一[1]。快速有效地分离、鉴定临床粪便样中的轮状病毒，不仅可以确证轮状病毒的感染，还可以准确监控轮状病毒流行株的变化，积累轮状病毒的流行病学数据。轮状病毒的基因组为双链RNA，分为 11 个节段，不同株型轮状病毒的 RNA 电泳图谱存在差异，可由此初步判定轮状病毒株型别[2]。本文以猴轮状病毒 SA11 株的 RNA 基因组作为模版，对 PAGE电泳和银染的检测条件进行优化，并使用优化后的条件对临床粪便样品进行检测。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

猴轮状病毒 SA11 株为本所保存；12 份临床样品来自云南昆明医学院附属第一医院，为儿科急性腹泻小儿粪便样本，收集的时间为 2009 年 11 月，随机编号 1～12 号；A 群轮状病毒胶体金诊断试纸购自北京万泰生物药业有限公司；小量液体样品 RNA 抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；小型垂直电泳槽购自 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

在不改变电泳设备的前提下，以猴轮状病毒 SA11 株为模版，对其 RAN 基因组的电泳条件进行了比较和优化，包括不同丙烯酰胺和N，N’-甲叉丙烯酰胺配比、分离胶、积层胶浓度、电压、电泳时间，银染的染色和显色时间。并以优化后条件对细胞培养的不同代次的轮状病毒 RNA 基因组进行检测和重复实验，确定其稳定性。

PAGE 电泳的缓冲液为 TBE，电泳结束后，使用 10%无水乙醇和0.5% 的冰乙酸洗涤凝胶 2 次，每次 5 min，然后使用 0.2% 的硝酸银溶液染色，显色液为 NaOH 和甲醛溶液。

使用 A 群轮状病毒胶体金诊断试纸对腹泻样品进行快速检测（具体方法参照该产品说明书），将阳性样品用20 mmol，pH 7.4 的 PBS 制成 10% 悬液，于 3724 × g 条件下，离心 30 min。上清用 0.2 µm 滤膜过滤后，取 250 µl滤液用 RNA 抽提试剂盒提取病毒 RNA，取 10 µl RNA 抽提物，然后进行 PAGE 电泳和银染检测。

2 结果

对 PAGE 电泳的条件优化如下：采用的聚丙烯酰胺凝胶选用了不同的丙烯酰胺和N，N’-甲叉丙烯酰胺配比，分别为 37.5∶1、29∶1、20∶1 和7.25∶1，分离胶浓度从 5%～20%，电泳时间从 3～15 h，电压从 60～120 V（表 1）。结果发现，采用丙烯酰胺和N，N’-甲叉丙烯酰胺配比为29∶1 的凝胶，3.5% 基层胶，10% 分离胶，以 60 V 电泳6 h，轮状病毒 RNA 基因组的 11 个节段可获得较好的分离。其次我们对银染的条件进行了优化，比较了染色时间和显色时间的长短对同一样品染色效果的影响，结果发现，使用新鲜配制的硝酸银溶液，染色 2 min 即可，延长时间对实验的结果没有影响，显色时间控制在 5 min 以内，可以有效地降低背景染色，提高对比度。重复实验的结果表明，该方法用于检测体外培养的不同代次的轮状病毒 RNA 基因组，结果稳定[3]。

表1 不同凝胶浓度、电泳时间及电压对分离效果的影响

利用上述条件对临床粪便样品中的轮状病毒 RNA 基因组进行检测，结果发现，1 号和4 号样品的 RNA 浓度较低，但是仍能看到轮状病毒的特异基因组带型，1 号和6 号的电泳背景较深，可能与粪便样品的成分有关，5 号样品的带型与 Wa 株相似，6 号和7 号的型别还有待于进一步的鉴定。

用 A 群轮状病毒胶体金试纸检测发现，12 份粪便样品中有 5份样品为抗原阳性，分别为 1、4、5、6、7 号样品。我们采用上述优化后的方法，对这 5 个样品抽提的RNA 进行检测（图 1）。

图1 临床粪便样品 1、4、5、6、7 号中轮状病毒 RNA 基因组的电泳图谱

3 讨论

轮状病毒的双链 RNA 基因组在凝胶电泳时分为 11个节段，7、8、9 三个条带的分子量较为相近：第 7 条 RNA与第 8 条 RNA 的大小相差 45 bp；而第 8 条 RNA 与第9 条 RNA 仅相差 3 bp，使用本文所述电泳设备，其制胶长度为 5 cm，这 3 个条带没有得到有效地分离，选用较长的凝胶可以解决这个问题，但是因为这 3 条带的电泳图谱在轮状病毒株型之间差异不明显[4]，因此目前的结果已经满足实验样品的检测需要。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的方法（PAGE-SS）作为检测轮状病毒 RNA 基因组的方法被广泛使用[5]，但是实验设备、实验条件的差异影响电泳结果，使得实验不仅耗时长，而且结果不具有可比性。我们在前期实验的基础上，比较了凝胶浓度、电泳时间、电压、银染的染色和显色时间等参数对 PAGE 结果的影响，优化得到了一个稳定快速的轮状病毒 RNA 基因组 PAGE-SS 检测方法。

[1]Madhi SA, Cunliffe NA, Steele D, et al.Effect of human rotavirus vaccine on severe diarrhea in African infants.N Engl J Med, 2010,362(4):289-298.

[2]Herring AJ, Inglis NF, Ojeh CK, et al.Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver-stained polyacrylamide gels.J Clin Microbiol, 1982, 16(3):473-477.

[3]Zhang GM, Zhang YX, Liu X, et al.Adaptability of rotavirus P[2]G3 strain in Vero cells.Chin J Biologicals, 2008, 21(12):1078-1079.(in Chinese)张光明, 张永欣, 刘馨, 等.轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性.中国生物制品学杂志, 2008, 21(12):1078-1079.

[4]Estes MK, Cohen J.Rotavirus gene structure and function.Microbiol Rev, 1989, 53(4):410-449.

[5]Giordano MO, Martinez LC, Depetris AR, et al.Rapid vertical agarose: silver stain detection of rotavirus.Viral Immunol, 1997, 10(1):59-64.