便秘二号方对慢传输型便秘大鼠Cajal间质细胞及C-KIT表达的影响

杨关根，刘智勇，杨琴燕，金建芬

便秘二号方对慢传输型便秘大鼠Cajal间质细胞及C-KIT表达的影响

杨关根1，刘智勇1，杨琴燕1，金建芬2

目的：观察便秘二号方对结肠慢传输型便秘大鼠模型的疗效，并检测其对大鼠模型结肠组织Cajal间质细胞及C-KIT表达的影响。方法：32只大鼠随机分为正常组、模型组、实验组、盐水对照组，每组8只。正常组给予正常饮食，其余3组采用大黄递增灌胃法制作慢传输型便秘大鼠模型。造模成功后，实验组予中药便秘二号方(方由当归、白术、黄芪、升麻、杏仁、枳实、肉苁蓉组成）灌胃，盐水对照组予生理盐水灌胃。30 d后以活性炭灌胃法检测结肠传输功能，以免疫组化法观察结肠组织Cajal间质细胞的形态和数量，采用RT-PCR法观察C-KIT mRNA表达。结果：炭末推进长度模型组明显少于正常组（P＜0.05），实验组明显高于盐水对照组（P＜0.05），推进率比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；实验组与盐水对照组相比，可见各肌层Cajal间质细胞数量增加，细胞形态恢复；实验组与盐水对照组的Cajal间质细胞个数比较，实验组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组C-KIT表达阳性率明显低于正常组，实验组C-KIT表达阳性率明显高于盐水对照组。结论：中药便秘二号方可以增强慢传输型便秘大鼠的结肠蠕动功能，增加结肠组织中Cajal间质细胞的数量，改善其形态，促进C-KIT表达。

结肠慢传输型便秘；便秘二号方；Cajal间质细胞；C-kit蛋白

结肠慢传输型便秘（slow transit costipation，STC）指结肠运动障碍、结肠内容物推进速度减慢或结肠收缩乏力。Cajal间质细胞(interstitial cells of cajal，ICC)是胃肠道神经系统的一种非神经但又与神经密切相关的特殊间质细胞,可能是肠道慢波的起博者，有潜在的控制胃肠道动力的作用。ICC减少在STC患者结肠动力障碍的发生机制中有非常关键的作用。酪胺酸激酶受体c-kit是ICC细胞的特异性标志物。本课题采用免疫组化和RT-PCR技术研究便秘二号方对STC大鼠结肠组织ICC及c-kit表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠32只，雌雄各半，清洁级，体重(200±10)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（许可证号:SCXK沪2007-0005），由浙江中医药大学动物实验中心饲养。

1.2 主要试剂和仪器 冰冻包埋切片机（德国Leica CM1900）；PCR仪（BIO-RAD公司，美国）；-4℃离心机（德国Eppendorf公司）；电泳仪（NYCP-34ACG,北京六一仪器厂）；紫外分光光度仪Smartspec3000型（美国BIO-RAD公司）；紫外灯透射凝胶成像仪系统（GELDOC,美国BIO-RAD公司）；微型漩涡混合器（H-1,上海精科实业有限公司）；兔多抗c-kit抗体（一抗）（美国Santa Cruz公司）；兔／鼠两步法试剂盒（二抗）（北京中杉）；丙酮；PBS；DAB显色液（北京中杉）；异丙醇（-5-）；RT试剂盒（立陶宛Fermentas）；PCR试剂盒（美国Promega）; Trizol（美国Promega）；DEPC水（美国Promega）；DNAmark（美国Promega）；大鼠c-kit上下游引物（由上海生工合成）:上游5’-AGTGGATGACCTC GTG GC-3’；下游5’-GTATTACTGCTACTGCTGTC-3’，产生285 bp的产物；大鼠β-actin上下游引物（由上海生工合成），上游5’-CATCTATGAGGGTTACGCG-3’,下游5’-CCAG GATAGAGCCACCAAT-3’，产物长度548 bp。

便秘二号方：当归15 g，白术30 g，黄芪30 g，升麻9 g，杏仁10 g，枳实9 g，肉苁蓉15 g等，由杭州市第三人民医院中药房水煎浓缩成200%煎剂。大黄粉约700 g（由杭州市第三人民医院中药房提供）。

1.3 分组及给药 32只大鼠随机分为4组，每组8只。正常组予正常饲料和水喂养，另外24只制做成STC大鼠模型后分为模型组、盐水对照组和实验组。实验组每只大鼠灌服便秘二号方10 mL/(kg·d)，约含生药2 g/mL，盐水对照组每只大鼠灌服生理盐水10 mL/(kg·d)。连续灌药30 d。模型组和正常组同样予以正常饲料和水喂养。

1.4 造模 造模方法根据文献[1]，模型组大鼠正常每日灌服大黄粉悬液，开始时大黄的用量为600 mg/(kg·d),以后每日在前日的基础上加倍，直到出现半数致泻保持此剂量到80%稀便消失。然后再在此基础上加倍给药，又有近半数大鼠出现腹泻。如此循环3次，待最后80%稀便消失1周后停药。诱导实验性STC大鼠模型。

1.5 标本采集 正常组和模型组造模成功1周，盐水对照组及实验组在停止灌胃1周后，均禁食不禁水24 h，用10%的活性炭悬液2 mL灌胃30 min后颈椎脱臼处死。立即剖腹，在横结肠部位取新鲜肠壁组织,置10%中性甲醛固定液中,用于形态学观察及免疫组化实验。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 活性碳推进试验检测肠道传输功能 碳末推进百分率(%)=(碳末前端与幽门的距离/肠道全长)× 100。摘除从幽门到直肠末端的全部肠道，在松弛状态下测量肠道的全长及活性碳混悬液在肠道内推进的长度，并计算活性碳混悬液推进长度与肠道全长的百分比。

1.6.2 Cajal间质细胞的形态学观察 肠壁组织取出后放于冰冻切片机中，用OCT包埋，切片，HE染色。每张切片染色阳性区域随机选择5个高倍镜视野（200×）观察，并选择结肠区域环肌层在400倍光学显微镜下数阳性细胞个数，以每个高倍镜视野下阳性细胞个数的平均值做统计学分析。

1.6.3 总RNA的提取 100 mg结肠组织用PBS冲洗两次，放入研钵中加液氮研磨成粉末状，然后加Trizol 1 mL（4℃），吹打组织溶解，收集在Eppendof管中，冰浴下超声破碎细胞5 s×3，每管加0.2 mL氯仿，振荡15 s后静置10 min，12 000 r/min 4℃离心15 min，转上层水相（约400 μL）于另一1.5 mL EP管中加等体积异丙醇，混匀，室温10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，加预冷的75%乙醇1 mL，7 500 r/min 4℃离心5 min，弃上清，干燥后溶于DEPC水中30 μL。

1.6.4 C-kitmRNA表达的RT-PCR反应 紫外分光光度定量记录每个样本RNA浓度，逆转录合成cDNA，逆转录步骤按照试剂盒说明书进行。再PCR扩增，反应条件为95℃5 min，94℃30 s，55℃30 s, 72℃1 min，36次循环，末次循环后72℃再延伸7 min，4℃终止反应，电泳30 min后，紫外灯下观察目的片断，用DNAmark测量条带分子量，证明PCR产物正确。有分子量相符片断者标志为阳性，无则标志为阴性。将每组C-KIT表达阳性和阴性例数计数。

1.7 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件包进行统计。各组数据采用表示，计量资料比较用两样本t检验，计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 炭末推进情况 模型组和正常组比较，模型组炭末推进长度小于正常组（P＜0.05），炭末推进率明显小于正常组（P＜0.01）；实验组与对照组比较，实验组炭末推进长度大于对照组（P＜0.05），推进率高于对照组（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠炭末推进长度以及推进率的比较

表1 各组大鼠炭末推进长度以及推进率的比较

注：与正常组比较，*P ＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较,ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

组别 n 肠道全长(cm)炭末推进长度(cm) 百分比（%）正常组 8 110.00±6.16 66.12±4.52 66.80±8.15模型组 8 110.50±5.86 58.88±5.87* 53.41±5.94**实验组 8 117.00±6.70 69.45±5.57Δ 59.97±3.91ΔΔ对照组 8 116.00±7.31 57.14±6.62 50.06±5.58

2.2 大鼠结肠Cajal间质细胞形态及分布观察 免疫组化DAB显色后光镜下观察,正常组见Cajal间质细胞胞膜和突起呈棕黄色，分布于整个结肠各肌层，但以环肌层最丰富。两组对照组与正常组相比各肌层Cajal间质细胞均有所改变。特别是环肌层和黏膜下环肌层表面区域更为明显，部分消失。残存的Cajal间质细胞其形态也出现异常，往往表现为突起变短、变钝。

2.3 大鼠结肠Cajal间质细胞数量改变 平均每个高倍镜视野下Cajal间质细胞阳性细胞个数比较，模型组（48.50±5.93）比正常组（97.00± 10.84）明显减少（P＜0.01），实验组（80.63±5.04）比盐水对照组（56.75±9.82）明显增多（P＜0.01）。

2.4 大鼠结肠c-kit mRNA表达 大鼠结肠组织中c-kit mRNA基因的表达结果,正常组阳性率高于模型组，实验组高于对照组。见表2。

表2 大鼠结肠组织c-kit mRNA表达

3 讨论

近来的研究发现，Cajal间质细胞数量及分布的改变在STC的发病中可能起着重要的作用[2]。有人发现STC患者乙状结肠全层Cajal间质细胞的体积显著减少，结肠环形肌层的神经结构也减少，提示Cajal间质细胞的体积减少可能在STC的病理生理中起重要作用[3]。长期服用刺激性泻剂可导致结肠黏膜、平滑肌和壁内神经病变，形成所谓“泻剂结肠”，而STC患者一般均有长期服用各类泻剂的病史。国内动物实验研究模仿STC患者服用泻剂的特点(服用剂量越来越大，而泻下作用越来越差)，应用常用的接触性泻剂酚酞或者大黄制成大鼠“泻剂结肠”模型，发现其泻剂结肠肌间丛Cajal间质细胞分布极不均匀，突起连接杂乱或不能相互连接形成网络。因而推测大鼠“泻剂结肠”结肠肌间丛Cajal间质细胞分布和网络的杂乱性是结肠慢波频率减慢的病理基础［4］。c-kit为一种原癌基因,位于5号染色体w位点上,它编码kit受体,后者属酪氨酸激酶膜受体。在ICC表达均表达c-kit,并且ICC能通过kit受体接受各种信号,如果阻断kit受体,不但ICC发育受到影响,而且其功能也将丧失,故ICC有无c-kit表达与肠道动力密切相关,因此可以利用c-kit抗体标记识别ICC。本实验研究结果表明，大鼠慢传输便秘模型结肠组织中各肌层ICC数量明显少于正常大鼠，且在形态上有所改变，表现为变短、变钝。用分子生物学方法研究慢传输型便秘大鼠结肠组织中c-kitmRNA表达产物，发现c-kitmRNA表达几乎检测不出，但是正常大鼠结肠组织中c-kitmRNA表达基本正常。

有人认为脾虚气弱是STC的基本病机，健脾益气是治疗STC的基本大法并通过实验证明提示生白术可以显著增强结肠纵肌和横肌的收缩作用［5］。临床运用表明，白术能有效治疗便秘。便秘二号方由黄芪、当归、白术、枳壳、肉苁蓉等组成，以补气健脾润肠为基本大法，黄芪和白术用量达到30 g，临床效果明显。本实验给慢传输型便秘大鼠灌服便秘二号方1个月后，大鼠肠鸣音明显较前活跃，活动范围和进食量增加，大便软而成形。对照组大便颗粒较干结，大鼠活动能力下降，喜欢扎堆，毛发纠结。实验组大鼠肠道传输速度较对照组有明显提高，而且大鼠结肠组织Cajal间质细胞数量增加，形态恢复正常，接近正常组大鼠，C-kitmRNA的表达也有所恢复。表明便秘二号方能够纠正c-kitmRNA的过低表达，改善结肠组织中的Cajal间质细胞的形态和功能，使慢传输型便秘大鼠结肠功能恢复正常。

[1]张连阳,高峰,童卫东,等.大鼠泻剂结肠模型的建立[J].华人消化杂志,1998,6(10):864.

[2]Aguchi T,Suita S,Masumoto K,et a1.Universal distribution of c-kit-positive cells in different types of Hirschsprung's disease[J]. Pediatr Surg Int.2003，19(4):273.

[3]Dickens EJ,Hirst GDS,Tomita T.Identification of rhythmically ac⁃tive cells in guinea-pig stomach[J].J Phsyiol，1999,514:515.

[4]Ward SM.Interstitial cells of Cajal in enteric neurotransmission. Gut.2000,47(4):40.

[5]丁曙晴，丁义江，郭荣,等.白术对豚鼠结肠体外肌条运动的影响[J].中国中西医结合消化杂志，2005,13（2）：102.

（收稿：2009-08-10修回：2009-12-22）

（责任编辑 刘洪斌 田在善）

Effect of Bianmi（便秘）No.2 Decoction on Interstitial Cells of Cajal and c-kit Expression in Slow Transit Constipation Rats

Yang Guangen,Liu Zhiyong,Yang Qinyan,et al The 3rd People’s Hospital of Hangzhou,Hangzhou(310009),China

Objective To study the effect of Chinese herbal medicine Bianmi’（便秘）Decoction on distribution and the morphology and quantity of interstitial cells of Cajal(ICC)as well as expression of c-kit mRNA in the colon tissue of slow transit constipation(STC)rats. Methods Thirty-two rats were divided into 4 groups randomly(8 rats each).The normal group was fed with normal food,the other three groups were induced into STC rats models with gavaging Dahuang.The experimental group was gavaged with Bianmi No. Decoction,10 mL/kg including crude drug 2 g/mL for 30 days.The control group was gavaged with the same volume saline.Then,the carbon powder propulsion rates in the intestine were measured and specimens were taken.The variation of morphology and number and expression of c-kit mRNA in ICC in the two groups were measured. Results Carbon powder propulsion length in the model group was shorter than that of the normal group(P＜0.05),and carbon powder propulsion rates were lower significantly(P＜0.01).The morphology of ICC became smaller and blunter and the number of ICC became smaller than of control(P＜0.05),the amount of expression of c-kit mRNA in the model group was less than control(P＜0.05). Conclusion Bianmi No, Decoction can resume the morphology and number of ICC in the colon tissue of STC rats and improve the amount of the expression of c-kit mRNA.

slow transit constipation,Bianmi No.2 Decoction，interstitial cells of Cajal,c-kit

R656.9

A

1007-6948(2010)02-0203-04

杭州市科技发展计划（20070333Q19）

1.浙江省杭州市第三人民医院肛肠科（杭州310009）

2.浙江省杭州市第二人民医院肛肠科（杭州310005）

杨关根,Tel:13957122968,E-mail:Yangguangen88@ 126.com