青海地区绵羊羔小隐孢子虫病的血清学调查

马利青,蔡其刚,陆 艳

(青海省畜牧兽医科学院,青海 西宁 810016)

寄生于羊的隐孢子虫主要对羔羊致病,轻者消瘦、阻碍生长,重者引发腹泻,甚至死亡,造成严重的经济损失。寄生于绵羊和山羊的隐孢子虫中,微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、人隐孢子虫(C.hominis)、猪隐孢子虫(C.suis)和隐孢子虫鹿基因型(Cervinegenotype)为人兽共患虫种和基因型[1]。在羊场饲养员中隐孢子虫感染阳性率明显高于非饲养人员,表明羊是人隐孢子虫病的一个保虫宿主[2]。

为了解青海省羔羊群中隐孢子虫的感染情况,我们于2009年5～8月份用纯化的C.parvum重组蛋白P23作为ELISA诊断抗原进行了羔羊隐孢子虫病的血清学流行病学调查,结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料 重组的C.parvum P23蛋白按文献记载的方法[3]进行了克隆、表达和纯化;阴、阳性标准血清由日本国家原虫中心玄学南博士惠赠,青海省畜牧兽医科学院生物技术研究室保存。

1.2 被检血清的采集和处理

1.2.1 671份被检血清均采自刚察县某羊场、共和县某羊场、海晏县某羊场和乌兰县某羊场的3～6月龄当年羔羊。

1.2.2 采血时均空腹、颈静脉采集,采集后摆成斜面,置4℃冰箱5 h后,放在室温待血清析出后收集血清,-20℃冷冻保存待检。

1.3 其他试剂和耗材 均购自国内和Sigma公司供应商。

1.4 ELISA

1.4.1 抗原的包被 抗原 P23和GST,按 5μg/mL剂量加到包被液中(50 mmol/L carbonate-Bicarbonate Buffer,pH值9.6),混匀后加到96孔平底微量板(Nunc,Denmark)的孔里,每孔 50μL,并且在4℃条件下培养过夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween-20的PBS冲洗1次后,残留的粘附物的部位用含3%脱脂乳的封阻液进行封阻,每孔 100μL,并在37℃条件下培养1 h。

1.4.3 加样 随后微量板用冲洗液冲洗1次,在封阻液中按1∶100滴度稀释被检血清后,每个样品平行加到微量板的两个孔中,每孔50μL,并在37℃条件下培养1 h。

1.4.4 加二抗 用冲洗液冲洗6次后,在封阻液中按1∶4000滴度稀释辣根过氧化物酶结合了兔抗羊的IgG抗体(Bethyl Laboratories,USA),稀释后每孔加50μL,并在37℃条件下培养1 h。

1.4.5 底物 用冲洗液冲洗6次后,每孔加100μL底物,每毫升底物中含有0.3 mg的2,2′azino bis(3 ethylbenz thiazoline 6 sulfonic acid),0.1 mol/L的柠檬酸,0.2 mol/L的磷酸缓冲液和0.003%H2O2,每孔加 100μL 。

1.4.6 读数 用Wellscan MK 3酶标读数仪(Labsystems Dragon,Finland)在光吸收值OD415 nm条件下测定光吸收值。

1.4.7 判定标准 ELISA滴度表示成最大稀释度的倒数,且展示ELISA值是等于或大于0.1,在抗原P23孔和 GST孔之间的光密度吸收值是不同的,两个孔之间的差值为该被检样品的光密度吸收值(OD值)。两孔阳性血清对照孔的平均值必须大于0.1;两孔阴性血清对照孔的平均值必须低于0.1;两孔待检样品的平均值等于或大于 0.1为阳性,低于 0.1为阴性。

2 结果

在所检测的671份血清中,检出C.parvum抗体阳性血清153份,阳性率为 22.80%。绵羊群中羔羊隐孢子虫的流行情况检测结果。见表1。

表1 绵羊群中羔羊隐孢子虫的流行情况检测结果

3 讨论

3.1 从本次检测的结果来看,本省羔羊群中不同程度的感染了C.parvum。

3.2 Brackett E J等[4]发现6头有严重隐孢子虫病小牛多数粪样中抗 p23抗体也成倍的增加,经研究认为,无论是在子孢子还是小配子阶段,p23是C.parvum感染的体液免疫反应的一个主要靶抗原,序列同源性的分析结果证明 P23蛋白是C.parvum的保守蛋白;同时,重组p23抗原免疫引起感染隐孢子虫的IFN-γ基因敲除Balb/c鼠的脾细胞和肠系膜淋巴结细胞特异地增生性反应,表明p23也是细胞免疫反应的一个重要的靶抗原。C.parvum的糖蛋白P23与虫体的附着和入侵宿主细胞有关,也是发病机制中推测的毒力因素之一,被公认为隐孢子虫诊断和疫苗制作的侯选基因之一[5]。

3.3 本试验中应用蛋白重组技术,获得P23重组蛋白,建立了基于P23蛋白的ELISA检测技术,并用于田间样品的检测,这为今后进一步开发C.parvum的ELISA诊断试剂盒打下了一定的基础。

[1]Xiao L,Fayer R,Ryan U,et al.Cryptosporidium tax onomy:Recent advances and implications for public health[J].Clin Microbiol Rev,2004,17:72-97.

[2]El-Sherbini G T,Mohammad K A.Zoonotic cryptosporidiosis in man and animal in farms,Giza Governorate,Egypt[J].J Egypt Soc Parasitol,2006,36(2 Suppl):49-58.

[3]T akashima Y,Xuan X,Kimata I,et al.Recombinant bovine herpesvirus-1 expressing p23 protein of Cry ptosporidium parvum induces neutralizing antibodies in rabbits[J].J Parasitol,2003,89(2):276-282.

[4]Brackett E J,M ason P H,Savidge J,et al.Excretion patterns of mucosally delivered antibodies to p23 in Cryptosporidium parvum infected calves[J].Vet Immunol Immunopathol,2000,76(3-4):309-317.

[5]Watts A M.Kennedy RC1 DNA vaccination strategies against infectious Diseases[J].Vaccine,1999(29):1149-1163.