猪轮状病毒油乳剂灭活疫苗的制备及免疫原性试验

史月明,葛俊伟,乔薪瑗,刘力威,张冠群,李一经

(1.东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.黑龙江省兽医研究所,黑龙江 齐齐哈尔 161006)

猪轮状病毒(porcine rotavirus)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒属(Rotavirus),是引起仔猪发生急性胃肠道传染病的重要病原,自1975年Woode和Bridge首次从猪体分离出猪轮状病毒以后,世界各国均有不同程度的猪轮状病毒感染报道。在我国猪轮状病毒感染亦十分普遍,李国平等在调查中发现仔猪1～10日龄阳性率42.4%～66%,10日龄到断奶阳性率83.2%～91.7%,断奶后阳性率为63.2%～72%[1]。临床症状主要表现为恶心、呕吐、腹泻,成年猪一般呈隐性感染。鉴于猪轮状病毒感染普遍,危害大,对猪进行疫苗接种预防猪轮状病毒感染具有重要意义。本试验旨在制备猪轮状病毒油乳剂灭活疫苗,并研究其免疫原性,为该疫苗的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒种、细胞和试验动物 猪轮状病毒系国内分离株JL94株细胞适应毒[2];MA-104细胞自武汉大学中国典型培养物保藏中心;家兔体重约2.5 kg,购自哈药集团实验动物中心。

1.2 检测抗原、抗体和主要试剂 重组猪轮状病毒VP6抗原,抗猪轮状病毒VP6蛋白单抗由本实验室制备保存[3-4];灭活剂BEI购自Alfa-Aesar公司;10号白矿油购自杭州炼油厂;司盘-80购自上海大众制药厂。

1.3 毒种的研究

1.3.1 原始毒种的鉴定 将猪轮状病毒JL94株细胞培养物接种MA-104细胞,进行扩大培养。将收获的病毒纯化后[5]通过电镜观察、RT-PCR[3]及测序进行鉴定。

1.3.2 种子批的建立 基础种毒的建立:取本实验室保存的原始种毒进行传代,每隔4代进行TCID50测定,当细胞毒价稳定在106.5～107.5TCID50/0.2mL,混匀后分装,保存于-86℃,制成基础种毒。

生产种毒建立:取基础种毒,进行扩大培养,混合后分装,保存于-86℃,制备成生产种毒,用于制备疫苗。

1.3.3 毒种的细菌和支原体检测 按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》进行检测[6]。

1.4 制备疫苗 灭活:生产种毒按终浓度1.5%加入BEI,37℃灭活24 h,加入2%硫代硫酸钠终止灭活。灭活后抗原原液、十倍和百倍稀释液接种MA-104细胞培养120 h,观察细胞病变。

油相制备:取10号白油,加入硬脂酸铝使其浓度达到2%,边加边搅拌,加热直至硬脂酸铝全部溶解为止。然后加入司盘-80,使其终浓度达到6%,搅匀后停止加热。

水相制备:将灭菌吐温-80加入到灭活病毒悬液中,使其终浓度达到4%～5%,充分搅匀,直到吐温-80彻底溶解。

乳化:取油相放入胶体磨中慢速搅拌,同时徐徐加入水相,使油相与水相体积比为1.5∶1,8000～10000 r/min乳化10 min。终止搅拌前加入1%硫柳汞,使其终浓度为0.01%。

1.5 疫苗物理性状测定 冷水表面试验:将疫苗数滴滴于冷水表面,观察是否扩散;黏度检测:室温用1mL吸管吸取疫苗1mL,使其自由落下,记录滴下0.4mL疫苗所需时间;稳定性试验:将疫苗3000 r/min离心15 min,分别置37℃和4℃冰箱观察分层情况。

1.6 家兔免疫 将家兔随机分为2组,命名为首免组和二免组。各组均肌肉注射猪RV灭活油佐剂疫苗免疫1.5mL/只;2周后二免组进行同剂量同批次疫苗加强免疫,免疫前各组采血1次及免疫后每周采血分离血清,分装后-86℃保存备用。

1.7 血清中猪RV特异性抗体水平检测 采用间接ELISA[7]和细胞中和试验[8]进行检测。

2 结果

2.1 原始种毒鉴定结果

2.1.1 电镜检查结果 纯化后病毒经电镜观察,病毒颗粒略呈圆形,直径为65 nm～75 nm,形似车轮,为典型的轮状病毒颗粒。见图1。

2.1.2 RT-PCR鉴定结果 VP6全基因长1356 bp,扩增产物约为1300 bp,与预期结果相一致,见图2。并将扩增产物通过序列测定与GenBank中JL94株VP6序列(AY538664)比对,相似度100%。

2.2 种子批毒种的建立 基础种毒的建立:将原始毒种JL94株进行培养,增殖到第58代,收获的毒价稳定在108.25TCID50/mL,见表1。将病毒按每包装5mL,-86℃冻存,建立基础毒种批。

图2 PRV JL94株VP6基因的RT-PCR结果

生产种毒的建立:将基础种子批病毒第58代进行扩大培养,按每包装400mL,-86℃冻存,建立工作毒种库。

表1 病毒TCID50的测定

2.3 毒种的细菌、支原体检测结果 毒种猪RV JL94株经检验,均无需氧菌、厌氧菌、真菌和支原体污染。

2.4 疫苗的制备结果

2.4.1 抗原液灭活检测 将BEI灭活抗原液的原液、10倍稀释液与100倍稀释液接种于MA-104细胞后120 h均无CPE出现,该抗原液灭活彻底。

2.4.2 疫苗物理性状测定 冷水表面试验:疫苗滴于冷水表面,油滴边缘整齐,不向四周扩散,说明疫苗是稳定的油包水型;黏度检测:1mL吸管吸取1mL疫苗室温垂直滴下所需时间为7～8 s,在规定的黏度范围内;稳定性试验:3000 r/min离心15 min,37℃放置21 d,4℃放置1年,疫苗均未出现分层现象,说明疫苗具有良好的的稳定性。

2.5 疫苗效力检验

2.5.1 间接ELISA检测家兔体内抗体水平 首免组和二免组家兔血清中IgG抗体效价均有明显的上升,峰值均为1∶9600,至免疫后的21周首免组的抗体效价仍能维持在1∶1000,二免组为1∶4000。见图3。

2.5.2 中和抗体试验检测家兔体内抗体水平 首免组和二免组家兔,抗体效价变化规律性基本一致,均在第3周抗体效价明显升高,峰值均为1∶1800,于免疫后14周抗体效价开始缓慢下降,免疫后21周,首免组的抗体效价仍维持在1∶119,二免组为1∶230。见图4。

3 讨论

本试验利用我国猪轮状病毒分离毒株JL94株制备油乳剂灭活疫苗,免疫家兔,通过细胞中和试验和间接ELISA试验,证明以该病毒为种毒,可以刺激机体产生免疫应答和保护性抗体,并呈现出一定的抗体消长规律。

为了保证疫苗的免疫原性,制备病毒抗原时使病毒液的感染力滴度达到106TCID50/mL以上[9]。鉴于此,本试验首先将猪轮状病毒分离株JL94株在MA-104细胞系上传代适应细胞,制备基础种毒。该病毒传至第58代,滴度达到108.25TCID50/mL,对其扩大培养,制备出生产种毒,作为制备疫苗的抗原液。

通过细胞中和试验和间接ELISA试验表明,首免组和二免组家兔血清抗体均升高明显,于免疫后21周首免组中和抗体效价和ELISA效价分别为1∶119和1∶1000;二免组为 1∶230和1∶4000。因轮状病毒主要感染仔猪,符合疫苗免疫仔猪后免疫持续期的要求。比较两种抗体检测方法可以看出,ELISA检测抗体变化规律和中和试验检测抗体变化规律大致相同,均在免疫后3周左右抗体效价明显升高,持续到16周开始呈现下降的趋势。同时也可看出,一次免疫和两次免疫的效果相当,进行一次免疫即可。ELISA抗体检测方法简单易行、操作方便,而中和试验检测方法比较繁琐,因此,在实际检测中采用ELISA方法也能反应疫苗免疫的有效免疫应答水平。上述试验结果为该疫苗的应用奠定了基础,疫苗对仔猪的保护尚待进一步研究。

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