羟苯磺酸钙胶囊微生物限度检查方法学验证研究

王玮，陶俊钰(安徽巢湖市药品检验所，巢湖市238000)

羟苯磺酸钙胶囊是一种改善微循环的新药，特别在治疗糖尿病性视网膜病变方面是唯一的成熟产品，在心肌梗死、静脉不适及血管保护、血栓形成等病症方面有着较好的临床作用，有一定的抗炎作用[1]。由于其可能具有一定抗菌作用，因此必须以适当的方法消除或抑制制剂中的抗微生物活性后，才能进行其微生物限度的检查。通过研究，笔者对霉菌和酵母菌采用常规法；对细菌采用薄膜过滤法，冲洗量为200 mL，每次100 mL；对控制菌采用常规法，建立了该制剂的微生物限度检查法并对方法进行了验证，以确定该药品所采用微生物限度检查方法的有效可行。

1 材料

1.1 仪器

净化工作台、托盘天平、HTY-ⅢA集菌仪、开放式薄膜过滤器(杭州高德泰林有限公司)；BIO-Ⅱ-A2生物安全柜(上海振梓空气净化设备有限公司)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械一厂)；YQL-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器、MJX-160B-Z霉菌培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

1.2 培养基

营养肉汤培养基、改良马丁液体培养基、改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖(BL)培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基、稀释剂(pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，稀释供试品用)均由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 试药

羟苯磺酸钙胶囊(上海海虹(实业)集团巢湖中辰药业有限公司，批号:071107、071108、071109，规格:每粒0.25 g)。

1.4 试验菌

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]，均由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法与结果

按《中国药典》2005年版二部附录ⅪJ有关微生物检查方法进行验证试验[2，3]。

2.1 菌液的制备

①取经35℃培养18～24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜营养肉汤培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10－5～l0－7，使成50～100 cfu·mL－1，经活菌计数后备用。②取经25℃培养24～48 h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10－5～10－6，使成50～100 cfu·mL－1，经活菌计数后备用。③取经25℃培养1周的黑曲霉改良马丁斜面培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液5 mL洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释至与标准比浊管浊度相当的孢子悬液，取此孢子悬液1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10－7，使成50～100 cfu·mL－1，经活菌计数后备用。

2.2 供试液制备

取10 g供试品，加入45℃的pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 mL，作为1∶10倍的供试液备用。

2.3 常规法

2.3.1 试验组。取1∶10倍供试液1 mL和1 mL已制备好的菌液，注入同一平皿，迅速倒入15～20 mL 45℃左右的相应琼脂培养基，待凝，每个菌株制备2个平皿。细菌在30～35℃培养箱中培养48 h；霉菌在23～28℃培养箱中培养72 h，点计菌落数，取均值。

2.3.2 菌液组。分别取菌液1 mL注入平皿内，每种菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组。同试验组方法，不加菌液，测定供试品菌数(本底菌)。

2.3.4 回收率测定。按公式:试验组的菌回收率(%)＝(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组的平均菌落数×100%(以下同)，计算回收率常规法的回收率，结果见表1。

表1 常规法的回收率试验结果(%，n＝5)Tab 1Recovery test results of routine method(%，n＝5)

从表1结果看，采用常规法检查供试品，人工污染5种菌株，金黄色葡萄球菌回收率小于70%，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌回收率不能满足3次独立试验都大于70%的要求，因此常规法不能用于细菌检查。另外，在3次独立的试验中，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均大于70%，因此可以采用常规法对该药品的霉菌和酵母菌进行计数检查。

2.4 培养基稀释法

2.4.1 试验组。取1∶10倍供试液每皿0.5、0.2、0.1 mL，分别与已制备好的1 mL细菌菌液注入同一平皿，迅速倒入15～20 mL 45℃左右的营养琼脂培养基，待凝，每个菌株制备2个平皿，倒置在30～35℃培养箱中培养48 h，点计菌落数，取均值。

2.4.2 菌液组。方法同“2.3.2”项下。

2.4.3 供试品对照组。同试验组方法，不加菌液，测定供试品菌数(本底菌)。

2.4.4 回收率测定。方法同“2.3.4”项下，结果见表2。

表2 培养基稀释法回收率试验结果(%)Tab 2Recovery test results of dilution method(%)

由表2可知，通过培养基将供试品吸收后，可消除本品对大肠埃希菌的抑制作用，使其回收率均达到70%以上，但金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率还是不能满足要求。

2.5 薄膜过滤法

2.5.1 试验组。取1∶10的供试液1 mL，加入到无菌开放式薄膜过滤器中，分别用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100、200 mL，每次50 mL进行冲洗。在最后一次冲洗液中分别加入已制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌1 mL，过滤，取出薄膜贴于琼脂培养基上，平行制备2张膜。

2.5.2 菌液组。分别取上述制备的菌液1 mL注入无菌开放式薄膜过滤器内过滤，贴膜，每种菌平行制备2张滤膜，分别测定所加的试验菌数。

2.5.3 供试品对照组。同试验组方法，不加菌液，测定供试品菌数(本底菌)。

2.5.4 回收率测定。方法同“2.3.4”项下，结果见表3。

从表3结果看，采用薄膜过滤法(冲洗量200 mL)检查供试品，人工污染3种细菌菌株，3次平行试验，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的回收率均大于70%，可用于供试品细菌检查。

表3 薄膜过滤法回收率试验结果(%)Tab 3Recovery test results of membrane filtration method(%)

2.6 控制菌(大肠埃希菌)检查方法的验证[4]

2.6.1 供试液的制备。同“2.2”项下1∶10供试液的制备。

2.6.2 试验组。取3批1∶10的供试液10 mL和大肠埃希菌悬液1 mL(约为50～100 cfu·mL－1)接种至100 mL BL培养基中，置于35℃培养18～24 h，取0.2 mL接种至5 mL MUG培养基管内，35℃培养5、24 h，置于366 nm紫外光下观察荧光，沿培养管管壁加入数滴靛基质试液，观察结果。

2.6.3 阴性菌对照组。取金黄色葡萄球菌作为阴性对照试验菌，方法同“2.6.2”项。

2.6.4 阴性对照组。取稀释剂10 mL取代供试液，其余同试验组操作。

2.6.5 阳性对照组。不加供试液，其余同试验组操作。

验证试验结果见表4。

表4 大肠埃希菌控制菌验证试验结果Tab 4Validation test of Escherichia coli

从表4结果看，阴性对照未检出大肠埃希菌，阳性对照检出试验菌，阴性菌对照组未检出阴性对照菌，试验组检出试验菌，说明可以采用常规法进行控制菌检查。

3 讨论

本试验结果表明，羟苯磺酸钙胶囊可采用薄膜过滤法、冲洗量为200 mL进行细菌数检查，霉菌和酵母菌数及控制菌(大肠埃希菌)可采用常规法进行检查。

温度对试验结果的影响:(1)冲洗液温度对试验结果的影响。本品细菌数检查采用薄膜过滤法，冲洗液的温度控制在45℃时，可以增加供试液的滤过性，降低抗菌活性。冲洗液的温度小于45℃时，药物及其辅料不能充分溶解，堵塞薄膜，供试液的滤过性降低，不利于消除该药物的抗菌活性；冲洗液的温度大于45℃时容易伤害药品中污染的杂菌，影响检测结果。(2)培养基温度对试验结果的影响。本品霉菌数检查采用常规法，培养基注入平皿中时应控制温度在45℃，高于45℃时易造成微生物受损或死亡，＜45℃时则培养基易凝固。

采用薄膜过滤法时，先加入少量稀释剂适当浸泡滤膜，可减少滤膜对药物的吸附，利于对药物抑菌因子的冲洗。

[1]孙素馨，王宏，孙晓芹.羟苯磺酸钙的药理及临床应用[J].中国医院药学杂志，2003，23(2):100.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(二部)[S].2005年版.北京:化学工业出版社，2005:附录93.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S].2005年版.北京:中国医药科技出版社，2005:6.

[4]王海华，韦涛.阿咖酚散微生物限度检查方法的验证[J].中国药房，2008，19(28):2222.