刺五加AFLP分子标记技术体系的建立1)

刘克武,于洋

(1.黑龙江省林副特产研究所,黑龙江省非木质林产品研发重点实验室,牡丹江 157011;2.北京林业大学材料科学与技术学院)

刺五加(Acanthopanacis senticosl)为五加科落叶灌木,其根、茎和叶具有较高的药用价值,具有调节血压,安神补脑,抗辐射,抗疲劳,增强免疫力的功效。不同种源和不同品种刺五加的有效成分差异很大,通过遗传改良可明显提高刺五加药用价值。传统的选育方法主要是根据树皮颜色及形状、枝形、叶形、果实产量等形态性状进行选择。但形态性状数量有限、多态性差、易受环境影响,选择效率低下。近年来,分子标记技术的发展和应用,为人们提高植物育种效率带来了希望。分子标记技术是建立在DNA序列多态性基础之上的,是基因型的直接反映。以分子标记为基础的分子标记辅助选择具有传统育种无可比拟的优越性,即传统育种从表现型推断基因型,而分子标记辅助选择可对基因型进行直接选择。AFLP(Amplified Fragment Length Ploymorphsim)标记技术是在RFLP技术和RAPD技术的基础上发展起来的一种高效分子标记[1]。该方法结合了RFLP和RAPD的特点,既具有RFLP可靠性好、重复性高的优点,同时又具有PCR的高效性、安全性和方便性的优点,适合所有生物基因组的检测,因此被认为是迄今为止最有效、最理想的一种DNA分子标记技术[2-5]。特别是在对生物遗传背景不甚了解的情况下,AFLP标记技术更可以显示出高效性和稳定性的特点。因此,AFLP分子标记被广泛用于生物遗传研究,如遗传连锁图谱的构建,目的基因的定位、品种鉴别、分类和系统发育研究等多个方面。本研究以来自不同种源的刺五加为材料,通过对AFLP反应体系各关键影响因素进行优化,建立适于刺五加的AFLP反应体系,为刺五加遗传图谱的构建和分子标记辅助选择育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

刺五加叶片来自6个种源,分别来自黑龙江省的牡丹江、虎林、绥棱、伊春和吉林省吉林和延边。每个种源的10个单株的等量叶片混合为测试样本。

1.2 DNA提取

第一种方法,按照 Rogers和Bendich(1988年报道)CTAB法(Cetyl triethyla mmonium bromide)[6]并略加改进后的程序进行,具体步骤如下:①取0.2g超低温保鲜的叶片,加液氮研磨,然后转入到1.5 m L离心管中,保存于-20℃冰箱中;②加入0.5m L 56℃的2×CT AB(2%CTAB 100mm T ris 20mm EDTA 1%PVP 1.4MNaCl)混匀并在56℃水浴中保温 5min;③加入0.2 m L 24︰1的氯仿异戌醇后,继续在56℃水浴中保温5min,然后振荡30min;④8000g离心10min,然后取上清液于另一离心管中;⑤在原离心管中再加入0.5m L 56℃1×CTAB(1%CTAB 50mmTris 10mm EDTA 0.5%PVP 0.7MNaC l)混匀,并在56℃水溶中静止保温5min,然后振荡15min;⑥再取上清液并与第一次取的上清液放入同一离心管中;⑦加入0.5m L异丙醇沉淀,然后用70%的乙醇清洗,风干后溶于TE中。

第二种方法,针对刺五加叶片组织富含酚类和糖类物质,基因组DNA较难提纯的特点。本研究采取了CTAB法试剂盒相结合的DNA分离方法(改良的试剂盒法),即先将研磨碎的叶片用 2×CTAB(2%CTAB 100mm Tris 20mm EDTA 1%PVP 1.4MNaCl)高盐溶液洗涤,去除多糖,然后利用 Universalgenomic DNA extraction kit(Ver.3.0,Takara,Dalian)试剂盒提取DNA。

1.3 AFLP分析

利用模板准备试剂盒(Template Preparetion Kit,LincoIn,Nebraka,USA)准备预扩增模板:酶切反应体积为12.5μL,含基因组DNA 100 ng,限制性内切酶EcoRI和MseI各1.25单位,在37℃条件下消化2 h;75℃加热15 min后转移至冰上,加入25μL接头和T 4 DNA连接酶混合液,20℃保温连接2 h;用具有一个选择性碱基的引物对连接产物进行预扩增。预扩增程序为:为 94℃变性30s,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,20循环。选择性扩增用AFLP选择扩增试剂盒(AFLP Selective Amplification Kit,LincoIn,Nebraka,USA)进行。以稀释10～20倍的预扩增产物为模板,用700 nm红外染料标记的含3个选择性碱基的选择性扩增引物进行选择性扩增。扩增程序为:第一次循环为94℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸1min,随后每次循环退火温度降低0.7℃共12个循环;接下来继续23个循环:94℃变性30 s,56℃退火30s,72℃延伸 1min,72℃延伸 7min。预、选择性扩增均在ABI9700型PCR仪上进行。选择性扩增产物加入2.5μL的凝胶加样缓冲液混匀,94℃变性3min,然后迅速置于冰上,取1μL,用7%的标准测序胶,凝胶电泳及数据分析在LI-COR 4300 DNA分析系统仪器上进行。电泳结束后图像信息自动保存在或读取多态性数据。

2 结果与分析

2.1 刺五加基因组DNA提取方法的优化

图1 刺五加叶片基因组DNA的提取

图2 刺五加叶片基因组DNA的PCR扩增

刺五加叶片富含酚类和糖类物质,基因组DNA较难提纯;AFLP标记技术对DNA质量要求也很高。本研究首先采取了CTAB法分离刺五加DNA,结果发现此种方法去除多糖不够彻底(图1),严重影响了DNA的酶切效果(数据未列出)。为提高DNA质量,本研究对刺五加DNA的提取方法进行了改良,采用CTAB法与DNA提取试剂盒相结合的方法提取DNA,结果表明,用改良的方法提取的刺五加基因组DNA的质量明显提高。从电泳图片(图1)可以看出DNA条带清楚,没有弥散现象发生,RNA去除比较干净,未发现有多糖等杂质存在。以改良后的DNA提取方法提取的DNA为摸板,用一个随机引物5'-ACAGCCTGCT-3'进行PCR扩增,结果表明PCR扩增效果良好(图2),说明该方法提取的DNA比较完整、纯度高无杂质,能满足有关酶切和PCR扩增实验的要求。

2.2 引物的扩增效果

用8个Eco RI引物和8个MseI引物组成的64对引物对来自牡丹江种源的刺五加进行扩增,结果表明,所有引物对均可扩增出中清晰可见的产物。其扩增产物的分布范围在80～500 bp之间,而主要分布在110～450 bp之间。图3是引物组合M-CAA/E-ACC、MCTG/E-ACA 、M-CAC/E-ACA 、M-CAC/E-AAG 、MCTG/E-AGC在牡丹江种源的刺五加中扩增情况。不同引物对的扩增效果存在很大差异,M-CAA/E-ACC扩增位点最丰富,扩增出54个位点;引物组合MCTA/E-AGG和M-CTC/E-AAC扩增效果最差,扩增出9个位点,64对引物平均扩增位点32个。不同引物组合扩增的多态性位点数差异很大,以引物同E-ACA或M-CTG组合的扩增效果最好,这2个引物产生的多态性位点分别是23个和21个;而以E-AGC或E-ACG组合的扩增效果较差与之组合的M-CTG/E-ACG和M-CTC/E-AGG多态性效最低,仅5个。可见不同引物组合的扩增效果相差非常大,进行引物组合的筛选非常重要。选用图3中所用的5对引物组合在6个刺五加种源中共扩增出89个多态位点。这些多态性分子标记为进一步研究刺五加不同种源间的遗传差异和进行分子标记辅助选择奠定了基础。

图3 刺五加AFLP分子标记分析

3 讨论

AFLP技术多态性丰富、灵敏度高、DNA用量少,但对DNA的纯度要求较高。许多木本植物,特别是刺五加的茎叶组织含有大量的多糖、多酚及其它次生代谢产物,用CTAB等常规方法或DNA提取试剂盒获得的DNA往往含有较多的多糖成分,使得DNA埋在多糖的粘稠胶状物中而难以溶解,严重影响了DNA的酶切效果和PCR效果。能否提取出高纯度DNA是制约刺五加分子标记遗传图谱的构建和分子标记辅助育种的研究进程重要因素之一。本研究为克服刺五加叶片次生代谢物多,影响DNA提取质量的问题,采用高盐CTAB去糖与试剂盒粘膜技术相结合方法。结果表明,利用该方法得到的刺五加基因组DNA质量明显提高,能够满足类似AFLP的要求。目前,根据AFLP标记因显色方法不同,分为同位素标记、硝酸银染色和荧光染料标记等3种方法。同位素标记和硝酸银染色方法,易造成环境污染和耗费时间长等缺点。利用红外荧光检测技术分析,通过Li-Cor4300DNA系统分析AFLP标记,可直接读取多态性条带,节省了染色或暴光等步骤,减少了射性污染和银离子污染。同时,由于灵敏度高使得获得的DNA指纹与相应的放射自显影和银染相比具有更强的可重复性。

[1]Fang DQ,Roosem L.Indentification of closely related citrus cultivars w ith intersimple sequence repeat markers[J].Theor Appl Genet,1997,95:468-471.

[2]Vos P,Hogers R,Bleeker M,Reijans M,van de Lee T,Hornes M,Frijters A,Pot J,Peleman J,Kuiper M,Zabeau M.AFLP:A new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acid Research,1995,23(21):4407-4414.

[3]王斌,翁曼丽.AFLP的原理及其应用[J].杂交水稻,1996(5):27-39.

[4]Mueller UG,Wolfenbarger LL.AFLP genotyping and fingerprinting[J].Trends Ecol Evol,1999,14(10):389-394.

[5]Morgante M,Olivieri AM.PCR amplified microsatellities as makers in plant genetics[J].The Plant,1993,3(1):175-176.

[6]Rogers SO,Bendich AJ.Extraction of DNA from plant tissues.In:Gelvin SB,Schilperoort RA(eds)Plant Molecular Biology Manual,A 6:l-10.Boston,MA:1988,Kluwer Academic Publishers.