两种糖尿病肾病大鼠模型的对比研究

孙惠力 程小燕 戈 娜 李顺民

广东省深圳市中医院肾病科(518020)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN) 是糖尿病常见的慢性并发症之一，在糖尿病人群中的发生率为20%～40%。在西方国家人群中，DN 已成为终末期肾功能衰竭(ESRD)的主要原因，也是糖尿病致命的主要原因[1]。我国DN发病率也呈逐年增多趋势，越来越成为急待解决的肾脏病。然而，糖尿病肾病的病因和发病机制极为复杂，迄今尚未完全明了。在对DN 进行机制研究时，比较生物学的方法是很重要的研究手段，因此，建立适当的动物模型，不仅为研究糖尿病肾病的病因、发病机制和病理生理改变提供重要的线索，而且能促进药物作用机制的研究和临床药物的开发。本文拟就两种常用的糖尿病肾病大鼠模型进行比较。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠，体质量200～225g，购自广州中医药大学医学实验动物中心。

1.2 试剂与仪器

链脲佐菌素(sigma，美国)，大鼠尿白蛋白测定试剂盒(Bethyl，美国)。逆转录扩增试剂盒、TaqDNA聚合酶(MBI，美国)，TRIzol试剂(Invitrogen life technologies，美国)。

大鼠代谢笼(Tecniplast，意大利)，ACCU-CHEK血糖仪(罗氏，德国)，无创大鼠血压计(IITC，美国)，普通光学显微镜(Olympus，日本)，PCR扩增仪(Biorad，德国)，水平电泳仪(Biometro，美国)，GelDoc-It凝胶成像分析系统(UVP，美国)。

1.3 动物分组

将32只雄性SD大鼠(200～225g)随机分成4组，A组:正常对照组(Con组，n=8)，注射枸橼酸缓冲液；B组:单肾切除组(Nx组，n=8)，大鼠接受右侧肾切除术，2周后腹腔注射枸橼酸缓冲液；C组:糖尿病组(DM组，n=8)，单剂量腹腔注射STZ 60mg/kg体质量；D组:单肾切除+糖尿病组(DM Nx组，n=8)，大鼠接受右侧肾切除术，2周后单剂量腹腔注射STZ 60mg/kg体质量。于开始注射STZ后72h后取大鼠尾静脉血测血糖，凡血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病大鼠模型制作成功。观察16周后收集标本。

1.4 标本的采集与检测

每4周断尾取血用血糖仪检测血糖，每4周检测血压一次，每4周将大鼠置于代谢笼内收集24h尿标本，记录尿量，按试剂盒说明书用ELISA法测定尿白蛋白水平。

1.5 肾脏组织病理学检测

于16周后，大鼠戊巴比妥钠麻醉后，剖开腹腔，摘除肾脏，称重，用中性甲醛固定，经脱水，透明，石蜡包埋，切片2μm，行MASSON染色，光镜观察。

1.6 RT-PCR

按照TRIzol试剂说明提取总RNA，cDNA的合成参照逆转录扩增试剂盒操作程序进行。利用Primer5软件设计目的基因引物，由上海博亚公司合成(表1)。反应体系50μL，反应条件:94℃预变性5min，94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸45s，经35个循环后充分延伸10min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统分析后，计算待测指标与内参GAPDH吸光度A的比值。

1.7 统计学

2 结 果

2.1 各组大鼠一般资料的比较

与Con组及Nx组相比较，DM组与DM Nx组大鼠的血糖、血压、尿白蛋白、血肌酐及24h尿量均显著升高，而血清白蛋白水平显著降低。与DM组相比，DM Nx组的尿蛋白水平显著升高，两组之间其它指标差异无显著性(表2)。

2.2 各组大鼠肾脏形态学的比较

与对照组相比，Nx组、DM组、DM Nx组大鼠肾重/体质量比值明显增加，且DM Nx增加更明显。与对照组相比，Nx组、DM组、DM Nx组大鼠肾小球体积明显增加，但三者之间差异无显著性。与对照组、Nx组相比，DM组、DM Nx组大鼠系膜基质明显增多，且DM Nx增多更明显。DM Nx大鼠肾小管间质出现局灶性纤维化，其余组肾小管间质未出现纤维化(表3，图1)。

2.3 两种糖尿病模型肾脏组织α-SMA 和E-cadherin mRNA表达水平的比较

表1 目的基因PCR引物序列

表2 各组大鼠的一般资料

表3 各组大鼠肾脏形态学的比较

图1 各组大鼠肾脏病理改变(Masson,200×)

图2 各组大鼠肾组织α-SMA mRNA的表达水平

RT-PCR结果显示，与Con组及Nx组相比较，DM组与DMNx组大鼠肾脏组织内α-SMA mRNA的表达水平均显著增高，且DM Nx组较

图3 各组大鼠肾组织E-cadherin mRNA的表达水平

DM组升高更明显；而E-cadherin mRNA的表达水平显著降低，且DM Nx组较DM组降低更明显(图2、3)。

3 讨 论

目前经典的1型大鼠糖尿病模型有两种。一种是单纯腹腔或静脉注射链脲佐菌素建立模型；另一种是先将一侧肾脏切除，然后腹腔或静脉注射链脲佐菌素建立模型。前者操作相对简便，但成模周期长，不利于动物实验的进行；而后者单侧肾切除后导致对例肾代偿性肥大，肾脏肥大是糖尿病肾病的一个独立危险因素，若再予链脲佐菌素注射，可以加速糖尿病肾病的形成，节省实验时间[2-4]。有研究表明，单肾切除可以增加糖尿病大鼠肾小球滤过率，增加肾血浆流量，增加肾小球系膜基质扩张面积及肾小球硬化指数[5]。我们的研究发现，单肾切除再行链脲佐菌素诱导的糖尿病模型与单纯腹腔注射链脲佐菌素的糖尿病模型相比较，肾重/体质量比值明显增加，系膜基质明显增多，并且16周后肾小管间质出现局灶性纤维化，表明单肾切除确实能加速糖尿病肾病的形成，并能更早的观察到肾脏纤维化，有利于进行进一步的干预性研究。

肾小管间质纤维化是糖尿病肾病发展至终末期肾病必经的病理过程，而EMT是导致细胞外基质过度积聚及肾小管间质纤维化的关键性因素。EMT的两个重要表现为①细胞极性的消失和细胞间连接的破坏，在此过程肾小管上皮细胞的部分表型丢失，如在细胞间紧密连接和黏附连接中起重要作用的ZO-1，E-cadherin表达下调；②在肾间质，小管上皮细胞表型完全丢失，转变为表达α-SMA的肌成纤维母细胞。我们的实验结果发现糖尿病大鼠肾小管上皮细胞存在α-SMA的表达，且肾小管上皮标志物E-钙粘蛋白表达下降，表明早期糖尿病肾病大鼠模型肾小管内存在EMT。这与文献报道一致[6]。单肾切除后STZ诱导的糖尿病肾病模型与单纯STZ诱导的糖尿病肾病模型相比，小管间质更早出现纤维化，可能与肾小管上皮细胞转分化程度更强有关。

[1]Lea JP,Nicholas SB.Diabetes mellitus and hypertension: key risk factors for kidney disease[J]. J Natl Med Assoc,2002,94(8 Suppl):S7-S15.

[2]Hostetter TH,Troy JL,Brenner BM.Glomerular hemodynamics in experimental diabetes mellitus[J].Kidney Int,1981,19(3):410-415.

[3]Steffes MW,Brown DM,Mauer SM.Diabetic glomerulopathy following unilateral nephrectomy in the rat[J].Diabetes,1978,27(1):35-41.

[4]O'Donnell MP,Kasiske BL,Daniels FX,et al.Effects of nephron loss on glomerular hemodynamics and morphology in diabetic rats[J].Diabetes,1986,35(9):1011-1015.

[5]Lopes GS,Lemos CC,Mandarim-De-Lacerda CA,et al.Effect of unilateral nephrectomy on renal function of diabetic rats[J].Histol Histopathol,2004,19(4):1085-1088.

[6]Thomas MC,Burns WC,Cooper ME.Tubular changes in early diabetic nephropathy[J]. Adv Chronic Kidney Dis,2005,12(2):177-186.