甘草总黄酮物质组分提取纯化工艺研究

姜红红，孟宪生，康廷国，包永睿

（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600）

在我国甘草药用历史悠久，得到广泛的应用。传统医学认为其有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效，有“十方九草”之说。据《中国药典》2010年版一部记载其原植物有3种，即乌拉尔甘草G.uralensis Fisch.、胀果甘草G.inflate Bat.和光果甘草G.glabra L.[1]。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黄酮、生物碱和氨基酸等化学成分，具有广泛的生理活性[2]。甘草酸目前研究较深入，由于近年来人们发现其中黄酮类成分有较强的生物活性，已成为新的研究热点。本实验着眼于此，将对甘草总黄酮进行提取纯化工艺研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

紫外可见光分光光度计（unico公司），安捷伦高效液相（Agilent 1100）（美国安捷伦公司），电子天平（ALC.1C.4）（Salto rius Group）。

1.2 试药

聚酰胺、NKA-9、AB-8、D101、HPD-600、HPD-400、HPD-300大孔吸附树脂（沧州宝恩有限公司），乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、冰醋酸（天津科密欧有限公司，分析纯），乙腈（色谱纯，Mtedia公司），甘草苷对照品（中国生物制品鉴定所，批号：111610-200604），甘草酸单铵盐对照（中国生物制品鉴定所，批号：731-9403），甘草（经本院翟延君教授鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.）。

2 方法与结果

2.1 甘草中总黄酮提取工艺的确定

2.1.1 方法

采用均匀设计[3]的方法确定考察因素为乙醇浓度、乙醇量、提取时间、提取次数、浸渍时间，并设定10个水平（表1）。将甘草生品粉碎（过60目筛），用天平精确量取分成若干袋，每袋净含量15 g。取甘草15 g置于圆底烧瓶中，按照均匀设计表回流提取，合并提取液，提取液于100℃水浴中浓缩挥散溶剂，加水定容至100 ml，备用。

表1 黄酮类提取优化均匀试验Tab.1 Flavonoid optimized uniform design programming

2.1.2 结果

2.1.2.1 UV 测定 取芦丁对照品溶液 1、2、4、6、8、10 ml于 25 ml量瓶中，分别加入0.5 ml、10%硝酸铝溶液，再用70%乙醇定容，UV检测；样品制备：取1 ml样品溶液，同上法，进行UV检测。检测波长：420 nm。结果见表2。

表2 紫外法对甘草物质组中总黄酮含量测定结果Tab.2 UV method determination results of total Flavonoids in Licorice material group

2.1.2.2 HPLC测定 样品制备同“2.1.2.1”。取甘草苷对照品溶液（0.1 mg/ml）2、4、6、8、10 μl，进样，进行 HPLC 检测；色谱柱：Phenomenex-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流速：1 ml/min；柱温：25℃；流动相：A-B（0.5%磷酸水溶液∶乙腈）梯度洗脱：0～10 min时 B 为 15%～25%；10～20 min时 B为 25%～32%；20～25min时B为32%～40%；25～40 min时 B为40%～55%。检测波长：210、254、276、360 nm。 HPLC 测定结果见表 3。

表3 HPLC法对甘草物质组中甘草苷含量测定结果Tab.3 HPLC method determination results of liquiritin in Licorice material group

2.1.2.3 提取结果 提取方程为：Y=108.4481-2.2939X5+0.0024X12-1.2721X32+0.0140X52-0.0073X62+0.6708X1X2-0.0131X1X5-2.7631X2X3+0.0611X2X5+0.0102X5X6，Q=0.0013，S=0.0364，R=1，F10，1=14067.3121＞F10，10.05=242。 最佳提取工艺：乙醇浓度为90%，12倍乙醇量，提取1次，提取时间1 h，提取前浸渍时间为5 h。

2.2 甘草总黄酮纯化工艺的确定

2.2.1 有机溶剂萃取总黄酮

取提取液 50 ml（0.15 g/ml），共 5份，分别加入石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮各50 ml，振荡10 min，静置30 min。分别取有机层，挥散溶剂，加入70%乙醇定容至50 ml，分别精密取2 ml，分别加入0.5 ml 10%硝酸铝溶液，再用70%乙醇定容，UV检测。结果见表4。

表4 不同提取溶媒提取总黄酮含量测定结果Tab.4 Contents of total Flavonoids with different extraction solvent

由表4可知，乙酸乙酯萃取液的总黄酮量最大而石油醚萃取液的总黄酮量最小，几乎没有，则选用石油醚萃取除去小极性物质，水层再用乙酸乙酯萃取得总黄酮物质组。以芦丁为对照品经UV测定计算纯度为67.24%，所以考虑用树脂[4]继续纯化。

2.2.2 树脂静态吸附与洗脱

静态吸附：选取不同极性的树脂NKA-9、HPD-600、聚酰胺、HPD-400、D-101、AB-8、HPD-300，各量取 10 ml与锥形瓶中，精密吸取样品100 ml（相当于原药材30 g）放入锥形瓶中静置24 h，过滤，滤液定容与100 ml量瓶中，备用。按“2.1.2”项下HPLC含量测定方法进行测定，计算吸附率，结果聚酰胺树脂吸附率最大为87%。

静态洗脱：过滤后的残渣各放入200 ml 95%乙醇静置24 h，过滤，滤液浓缩定容与100 ml量瓶中，备用。按“2.1.2”项下HPLC含量测定方法进行测定，结果聚酰胺树脂解析率最大为47%，最终筛选出吸附率与解析率均最大的聚酰胺树脂作为纯化树脂。

2.2.3 动态吸附与解吸

2.2.3.1 泄露曲线 取聚酰胺树脂20 ml上树脂柱，上样量为100 ml（0.15 g/ml），做泄露曲线，经泄露曲线得最大上样量为90 ml（0.15 g/ml）。

2.2.3.2 动态吸附与解析 通过正交设计，选取因素为上样浓度、流速、径高比、上样液 pH值，并设定3个水平，做 L9（34）正交试验，以HPLC测定结果为指标确定最佳纯化工艺。得上样液pH值项有显著性差异，得最佳树脂纯化工艺为上样液PH值为5，流速为1 ml/min，径高比为1/10，上样浓度为0.15 g/ml。再对解析液进行考察：选择90%、80%、70%、60%、50%乙醇分别进行洗脱，洗脱液浓缩定容备用，按“2.1.2”项下UV含量测定方法进行测定，结果确定70%乙醇洗脱为最佳洗脱液；再对解析液用量进行考察：选择3BV、4BV、5BV、6BV、7BV 70%乙醇洗脱液浓缩，定容，备用，按“2.1.2”项下UV含量测定方法进行测定，以芦丁为对照品测定计算6BV 70%乙醇洗脱液纯度为81.74%，为最高纯度，所以确定洗脱液为6 BV 70%乙醇。由于纯度不理想，所以选用乙酸乙酯又进行萃取纯化结果纯度为87.41%，纯度没有达到90.00%，则选用同样条件再过一次聚酰胺树脂，以芦丁为对照品经UV测定计算出纯度为90.12%。

3 讨论

通过均匀试验结合回流的提取方法，全面地考察了总黄酮提取所涉及的因素与水平，因为均匀设计考察的水平数量较均匀设计多，使结果更加合理。

通过UV检测总黄酮并辅以HPLC测定甘草苷含量，结果均显示总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度为90%，12倍乙醇量，提取1次，提取时间1 h，提取前浸渍时间为5 h。增加浸渍时间，减少加热回流提取时间和提取次数，节省了能源。

通过树脂动静态考察最终确定过2遍聚酰胺树脂且聚酰胺的粒度为200～300目。通过石油醚萃取除去大部分小极性物质使纯度达到67.00%；通过有机萃取结合树脂工艺有效地纯化甘草总黄酮，使其纯度达到90.12%。

通过有机溶剂萃取时，把极性相似的三萜类同时提取出来了，导致纯度一直上不去太高，所以通过树脂柱来进行进一步纯化；选择了不同极性又是常用与黄酮醇化的树脂进行静态吸附与解析，选择出最佳吸附率尤其最佳解析率的聚酰胺树脂进行纯化实验[4-8]；首先对聚酰胺树脂的最大上样量进行动态考察，通过以甘草苷为指标的HPLC含量测定绘制出泄露曲线并确定最大上样量为90 ml（0.15 g/ml）；确定最大上样量之后，又对动态树脂吸附条件通过L9（34）正交试验进行了考察，得到最佳树脂动态吸附条件；对树脂动态解析条件进行摸索，通过UV测得含量最终确定最佳解析条件为6 BV入70%乙醇洗脱；由于纯度仍不理想尝试用有机溶剂在萃取纯度仍上不去，且考虑到毒性，所以又一次选择聚酰胺树脂用相同静动态条件进行纯化经UV含量测定纯度为90.12%。

通过均匀试验确定了甘草黄酮类的最佳提取工艺为乙醇浓度为90%，12倍乙醇量，提取1次，提取时间1 h，提取前浸渍时间为5 h。通过有机萃取试剂筛选实验确定选用石油醚萃取的方法除去小极性物质，水层再用乙酸乙酯萃取得总黄酮物质组，纯度可达67%；通过树脂动静态的考察结合正交试验确定甘草总黄酮物质组最佳工艺参数即选用聚酰胺树脂；上样液pH值为5，流速为1 ml/min，径高比为1/10，上样浓度为0.15 g/ml；洗脱液为6 BV 70%乙醇；且以相同条件过2遍聚酰胺树脂，纯度最终达到90%。通过UV、HPLC仪器的检测建立了测定甘草黄酮类含量的分析方法，为甘草的质量控制提供一定依据。通过一系列的提取与纯化实验，最终确定了甘草总黄酮的提取纯化工艺参数，为基础实验研究及有效物质组的机制研究提供科学可信合理有效物质基础。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2010:80-81.

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[3]马轶,孟宪生,包永睿.大孔吸附树脂对淫羊藿中总黄酮及淫羊藿苷吸附纯化的研究[J].亚太传统医药,2009,5(9):48-50.

[4]Yuan WK,Bai F,Yang B,et al.Extraction and purification methods of glycyrrhizic acid[J].Chin J Pharm,2002,33(7):362-364.

[5]郑虎占,董泽宏,余靖.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版社,1998:2853-2854.

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