恰玛古蜜膏对小鼠免疫功能的影响

孙 艳 ，安熙强 ，马 媛 ，张 涛 ，姚 华 ，贾鸿雁 ，张亚辉

（1.石河子大学药学院，新疆石河子 832000；2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐 830004；3.新疆柯坪圣泉实业有限公司，新疆乌鲁木齐 830000）

恰玛古（芜菁，Brassica campestris）是一种草本十字花科植物，又称蔓箐、狗头芥等。《中国中草药大全》、《维吾尔药志》、《中华人民共和国卫生部药品标准（维吾尔药分册）》等对恰玛古的植物来源、药材性状、化学成分、药理作用等都有详细记载。恰玛古为一种无毒副作用的植物，具有性温排毒、提高机体免疫功能、促进消化、清肺、消肿、降血脂、抗癌等药理作用[1]。恰玛古蜜膏由恰玛古和蜂蜜为主要原料制成，本文通过实验研究对其在调节机体免疫功能方面的作用进行初步探讨，为进一步开发其药用价值提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种小鼠，雌雄兼用，体重18～22 g，均由新疆医科大学实验动物中心提供，动物合格证号[新医动字（新）syxk2003-0001]。

1.2 受试样品与试剂

1.2.1 受试样品 恰玛古蜜膏，棕黄色，膏状，成人每次20～50 g，每天3次，由新疆柯坪圣泉实业有限公司研制（批号20090203）。

1.2.2 试剂 二硝基氯苯（DNCB）（天津市光复精细化工研究所，批号20070421）；丙酮（天津市科密欧化学试剂开发中心，批号20060301）；麻油（新疆馨泉投资有限公司，批号20080204）；印度墨汁（Solarbio试剂公司）；硫化钡（西安化学试剂厂，批号051022）；碳酸钠（天津市盛淼精细化工有限公司，批号070520）；生理盐水（新疆制药厂，批号 07110721）。

1.2.3 试液配制 4%Giemsa染液（姬姆萨染料1.0 g、甘油66.0 ml、甲醇 66.0 ml）；Alsever溶液（葡萄糖 4.10 g，柠檬酸钠 1.60 g，氯化钠0.84 g，蒸馏水200 ml，无菌过滤）；都氏试剂（碳酸氢钠 0.500 g，氰化钾 0.025 g，高铁氰化钾 0.100 g，蒸馏水500 ml）。

1.3 实验仪器

SP-752分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；80-2离心机（江苏省金坛市医疗仪器厂）；显微镜CH30（日本OLYMPUS产品）；立式压力蒸气灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.4 方法

1.4.1 恰玛古蜜膏对二硝基氯苯诱导的小鼠迟发型超敏反应（DTH）的影响[2-4]选取昆明种小鼠40只，体重18～22 g，按性别、体重随机分为4组，分别为模型对照组和恰玛古蜜膏3个剂量（40、20、10 g/kg）给药组，各给药组连续灌胃给药 13 d，模型对照组给等量的蒸馏水（DW）。于给药后第8天，每组小鼠用8%硫化钡涂抹于腹部脱毛，范围约3 cm×3 cm，每组小鼠均用 1%DNCB 丙酮麻油溶液（1∶1）50 μl均匀涂抹于褪毛区致敏，并于第2天再强化1次。致敏5 d后，将1%DNCB溶液10 μl均匀涂抹于各组小鼠右耳廓两面进行攻击。攻击24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳片，用打孔器取下直径8 mm的耳片，称重，以肿胀度来表示DTH的程度，计算肿胀抑制率。

肿胀度=右耳重-左耳重。

肿胀抑制率（%）=[（模型组肿胀度－给药组肿胀度）/模型组肿胀度]×100%。

1.4.2 恰玛古蜜膏对小鼠单核-巨噬细胞碳清除能力的影响[5-7]选取昆明种小鼠40只，体重18～22 g，按性别、体重随机分为4组，分别为空白对照组和恰玛古蜜膏三个剂量（40、20、10 g/kg）给药组，各给药组连续灌胃给药10 d，对照组给等量的蒸馏水。末次给药1 h后，各组小鼠尾静脉注射印度墨汁生理盐水溶液（1∶4），按每10 g体重注射0.1 ml计算。各组小鼠分别于注射后 2 min（T1）和 10 min（T2）眼眶取血 20 μl，加入 2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，摇匀后于600 nm测吸光度值A1和A2，将动物处死后，取肝、脾称重，计算碳廓清指数K值和吞噬指数α。

1.4.3 恰玛古蜜膏对小鼠血清中IgM抗体水平的影响[8-9]选取昆明种小鼠40只，动物分组及给药剂量同“1.4.2”，各给药组连续灌胃给药12 d，对照组给等量的蒸馏水。各组小鼠均在第4天给药后2 h腹腔注射SRBC悬液0.2 ml/只。末次给药1 h后，眼眶取血，离心分离血清，用生理盐水稀释200倍后按表1加样。

表1 测定样品吸光度值的加样Tab.1 The spotting blank of determining the absorbance of sample

各管加样后于37℃水浴保温10 min，水浴终止反应后离心（2000 r/min，10 min）。取上清液1 ml加都氏试剂3 ml于试管内。同时取SRBC稀释液0.25 ml、都氏试剂4 ml于另一支试管内，充分摇匀，放置10 min，于540 nm处以对照管作空白，分别测定各管吸光度值，计算半数溶血值HC50和抑制率。

HC50=（样品吸光度值/SRBC半数溶血吸光度值）×血清稀释倍数。

抑制率（%）=[（对照组 HC50－给药组 HC50）/对照组 HC50]×100%。

1.4.4 恰玛古蜜膏对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响[10-12]选取昆明种小鼠40只，动物分组及给药剂量同“1.4.2”，各给药组连续灌胃给药10 d，对照组给等量的蒸馏水。于末次给药1 h后，各组小鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.4 ml，8 h后处死，剖腹露腹膜，向腹腔内注入生理盐水2 ml，轻揉腹部1 min，吸取腹腔液0.2 ml涂于载玻片上，37℃孵育30 min，取出，以生理盐水冲洗玻片，吹干，丙酮-甲醇（1∶1）固定 5 min，4%Giemsa染液染色 3～5 min，用蒸馏水漂洗，晾干后，在显微镜下观察200个巨噬细胞，计算吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100%。

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 恰玛古蜜膏对二硝基氯苯诱导的小鼠迟发型超敏反应的影响

不同剂量的恰玛古蜜膏都有提高小鼠耳肿胀度的作用，与对照组比较，恰玛古蜜膏40 g/kg和20 g/kg剂量肿胀度显著高于对照组（P＜0.01或P＜0.05），说明恰玛古蜜膏能明显增强DNCB引起的迟发型超敏反应，可激活T淋巴细胞和巨噬细胞。结果见表2。

表2 恰玛古蜜膏对小鼠迟发型超敏反应的影响（，n=10）Tab.2 Effects of Brassica Campestris Ointment on delayed type hypersensitivity in mice(,n=10)

表2 恰玛古蜜膏对小鼠迟发型超敏反应的影响（，n=10）Tab.2 Effects of Brassica Campestris Ointment on delayed type hypersensitivity in mice(,n=10)

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别 只数 剂量 肿胀度 肿胀抑制率（g/kg） （%）对照组10-15.4±8.5-恰玛古蜜膏10 g/kg剂量组101022.7±9.621.45恰玛古蜜膏20 g/kg剂量组102019.3±7.9*33.22恰玛古蜜膏40 g/kg剂量组104018.9±7.2**34.60

2.2 恰玛古蜜膏对小鼠单核-巨噬细胞碳清除能力的影响

不同剂量的恰玛古蜜膏都有提高小鼠单核-巨噬细胞碳清除能力的作用，与对照组比较，恰玛古蜜膏40 g/kg剂量可明显提高小鼠碳廓清指数K和吞噬指数α（P＜0.01），20 g/kg剂量可提高小鼠巨噬细胞廓清指数K和吞噬指数α（P＜0.05），说明恰玛古蜜膏能够提高小鼠单核-巨噬细胞的碳清除能力。结果见表3。

表3 恰玛古蜜膏对小鼠巨噬细胞碳清除能力的影响（，n=10）Tab.3 Effects of Brassica Campestris Ointment on the function of phagocytosis in mice(,n=10)

表3 恰玛古蜜膏对小鼠巨噬细胞碳清除能力的影响（，n=10）Tab.3 Effects of Brassica Campestris Ointment on the function of phagocytosis in mice(,n=10)

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别 只数 剂量 碳廓清 吞噬（g/kg） 指数K指数α对照组10-0.017±0.0065.040±0.367恰玛古蜜膏10 g/kg剂量组10100.019±0.0075.121±0.910恰玛古蜜膏20 g/kg剂量组10200.022±0.009*5.280±0.752*恰玛古蜜膏40 g/kg剂量组10400.027±0.004**5.641±0.843**

2.3 恰玛古蜜膏对小鼠血清中IgM抗体水平的影响

不同剂量的恰玛古蜜膏都有提高小鼠血清中IgM抗体水平的作用，恰玛古蜜膏40 g/kg剂量与对照组比较，差异有统计学意义；半数溶血值HC50显著高于对照组（P＜0.05），说明恰玛古蜜膏可促进小鼠血清中IgM抗体的生成。结果见表4。

表4 恰玛古蜜膏对小鼠血清溶血素含量的影响（，n=10）Tab.4 Effects of Brassica Campestris Ointment on productions of hemolysin in mice(，n=10)

表4 恰玛古蜜膏对小鼠血清溶血素含量的影响（，n=10）Tab.4 Effects of Brassica Campestris Ointment on productions of hemolysin in mice(，n=10)

与对照组比较，*P<0.05

组别 只数 剂量 半数溶 抑制率（%）（g/kg） 血值HC50对照组10-18.6±4.3-恰玛古蜜膏10 g/kg剂量组101021.7±5.8-16.97恰玛古蜜膏20 g/kg剂量组102023.6±15.8-26.97恰玛古蜜膏40 g/kg剂量组104029.9±14.3*-60.50

2.4 恰玛古蜜膏对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

不同剂量的恰玛古蜜膏都有提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的作用，恰玛古蜜膏40 g/kg剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数明显高于对照组（P＜0.05）。结果见表5。

表5 恰玛古蜜膏对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（，n=10）Tab.5 Effects of Brassica Campestris Ointment on phagocytosis of mouse peritoneal macrophages(,n=10)

表5 恰玛古蜜膏对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（，n=10）Tab.5 Effects of Brassica Campestris Ointment on phagocytosis of mouse peritoneal macrophages(,n=10)

与对照组比较，*P<0.05

组别 只数 剂量 吞噬 吞噬指数（g/kg） 百分率（%） 对照组10-16.2±1.70.252±0.046恰玛古蜜膏10 g/kg剂量组101016.9±2.70.275±0.032恰玛古蜜膏20 g/kg剂量组102018.7±4.10.313±0.079恰玛古蜜膏40 g/kg剂量组104018.9±3.4*0.299±0.042*

3 讨论

实验结果显示，恰玛古蜜膏能提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，明显增强DNCB引起的迟发型超敏反应，提高小鼠单核-巨噬细胞清除血液中碳粒的能力，提高小鼠血清中IgM抗体水平。因此，根据实验结果可判定恰玛古蜜膏具有良好的增强免疫功能的作用，是一种良好的免疫促进剂。目前对恰玛古在其药理方面作用的研究甚少，本研究初步显示了恰玛古在提高机体免疫功能方面的药理作用，为其进一步开发恰玛古的药用价值提供必要的依据。

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