消岩汤不同时段联合化疗对Lewis肺癌小鼠免疫功能的影响*

贾英杰 ，李小江 ，杨佩颖 ，孙一予 ，张蕴超 ，黄敏娜 ，包芳芳

（1.天津中医药大学第一附属医院肿瘤科，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级健康近交系C57BL/6小鼠，64 只，雌性，6～8 周龄，体质量（20±2）g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物合格证号：SCXK（京）2007-0001。饲养于天津中医药大学实验动物中心，动物分笼饲养，自由摄食、饮水，室温（20±2）℃，湿度20%～40%。

1.2 细胞株 小鼠Lewis肺癌细胞，购自天津市医药科学研究所。

1.3 实验药物

1.3.1 消岩汤 方由黄芪、太子参、夏枯草、生牡蛎、白花蛇舌草、蜂房、姜黄、郁金等药组成，140 g生药煎出300 mL汤剂，每1 mL药液含生药0.47 g，由天津中医药大学第一附属医院药剂科提供生药并煎煮。按照等效剂量公式，小鼠每日给药为0.154 L/kg，后经旋转蒸发仪浓缩至相应倍数。

1.3.2 注射用顺铂粉针剂 每支20 mg，齐鲁制药有限公司，国药准字H37021357。

1.4 实验试剂[Mouse干扰素（IFN-γ）检测试剂及Mouse白介素-2（IL-2）检测试剂] 标准品及标准稀释液各1瓶，精密度微孔板1块，显色剂12 mL，终止液6 mL，25倍浓缩液30 mL，辣根过氧化物酶（HRP）稀释液12mL，抗鼠IFN-γ生物素偶联物2瓶，抗鼠IL-2生物素偶联物2瓶，标记亲和素2瓶，生物素稀释液12 mL等，均购自尚柏生物医学技术（北京）有限公司。

1.5 实验仪器 万分之一电子天平；手术剪；眼科剪；离心机；低温冰箱；酶标检测仪；自动平衡离心机等。

2 实验方法

2.1 实验分组 取小鼠60只，称质量后随机分为6组。A组：空白对照组，B组：荷瘤空白对照组，C组：单纯顺铂组，D组：化疗前7 d天运用消岩汤加顺铂组，E组：化疗前3 d运用消岩汤加顺铂组，F组：消岩汤同时加顺铂组，每组10只。

2.2 Lewis肺癌模型的建立 A组外其余5组进行造模。Lewis肺癌瘤株接种于余下4只C57BL/6近交系小鼠右腋部皮下，14 d后，无菌剥离荷瘤小鼠皮下瘤块，将瘤组织剪碎，研磨，用生理盐水稀释，调整细胞浓度为1×104个/L，于B组、C组、D组、E组、F组小鼠右腋部皮下注射接种肺癌瘤株，0.2 mL/只。

2.3 给药剂量及方法

2.3.1 化疗方法 C组、D组、E组、F组小鼠接种肺癌瘤株第7天，用生理盐水把20 mg顺铂稀释成0.25 g/L顺铂注射液，小鼠腹腔注射0.2 mL/只，连续注射5 d。

2.3.2 消岩汤给药方法 D组化疗前7 d开始使用消岩汤，E组化疗前3 d开始使用消岩汤，F组化疗开始同时使用消岩汤，每日8∶00、17∶00分别予消岩汤灌胃1次。按照等效剂量公式，小鼠每日给药为0.154 L/kg，连续给药至小鼠接种肺癌瘤株后第12天。给药期间，各组小鼠自由饮水、进食。

2.4 观察指标

2.4.1 小鼠生长活动状态观察 实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。

2.4.2 小鼠体质量变化情况 于开始给药前1 d给每只小鼠称体质量，于末次给药后24 h再次称体质量。记录数据，分析。

2.4.3 肿瘤抑制率 末次给药后24 h，Lewis肺癌小鼠颈椎脱臼处死。处死的小鼠用大头针仰面固定于塑料泡沫板上，眼科剪分离剥取肿瘤，电子天平称体质量，计算瘤质量与瘤肿抑制率。瘤肿抑制率=（l－实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100%。

2.4.4 脾脏指数、胸腺指数测定 脱颈处死动物后，剥离胸腺及脾脏立即用万分之一电子天平称体质量，称体质量后分别计算胸腺指数及脾脏指数。

胸腺指数=胸腺质量（mg）/小鼠质量（g）

脾脏指数=脾脏质量（mg）/小鼠质量（g）

2.4.5 IFN-γ、IL-2含量测定 末次给药后24 h将各组小鼠摘眼球取血2～3 mL，置于抗凝管内，4℃，3000 r/min，离心5 min，取血清置于-20℃保存。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，具体操作按尚柏生物医学技术（北京）有限公司提供的小鼠IFN-γ ELISA、小鼠IL-2 ELISA试剂盒进行检测，通过血清样品的OD值可在绘制的标准曲线上查出相应的细胞因子IFN-γ、IL-2的浓度。本实验采用计算机软件，绘制标准曲线，计算样品含量。

2.5 统计学方法 使用SPSS11.5统计软件数据包处理数据，计量资料分别以均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05为显著性水准。用单因素方差分析（Oneway ANOVA）比较多组间均值差异。如果差异有显著性意义，则需要作进一步的样本均数之间的两两比较，用Student Newman Keuls检测。

3 实验结果

3.1 生长一般状态观察 实验结束后，顺铂组小鼠注射顺铂3 d后表现身材瘦小，活动少，喜群居，进食明显减少，毛发缺少光泽；各顺铂加消岩汤组脱毛现象少于顺铂组，活动力优于顺铂组，其中化疗前7 d及3 d运用消岩汤加顺铂组效果最佳。

3.2 小鼠体质量变化 如表1所示，治疗前各组小鼠体质量无明显差异（P＞0.05），具有可比性。治疗后，各组小鼠体质量出现明显差异（P＜0.05），其中与荷瘤空白对照组比较，顺铂组及消岩汤同时加顺铂组体质量显著下降（P＜0.01），化疗前7 d运用消岩汤加顺铂组体质量明显下降（P＜0.05）。

3.3 肿瘤抑瘤率 如表1所示，各组小鼠瘤体质量具有显著差异（P＜0.01），其中与荷瘤空白对照组比较，顺铂组瘤质量明显降低（P＜0.05），其余各组瘤质量均显著下降（P＜0.01）。与单纯化疗组比较，化疗前7 d运用消岩汤加顺铂组及化疗前3 d运用消岩汤加顺铂组瘤质量明显下降（P＜0.05）。

表1 治疗前后小鼠体质量变化情况及瘤体、抑瘤率情况(x±s)Tab.1 Body weight and humor、inhibition rate(x±s)

3.4 各组小鼠胸腺指数、脾脏指数的变化 如表2所示，各组小鼠胸腺指数、脾脏指数具有显著差异（P＜0.01）。与顺铂组相比，化疗前7 d运用消岩汤加顺铂组、化疗前3 d运用消岩汤加顺铂组及消岩汤同时加顺铂组均能显著提高荷瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数（P＜0.05）；与荷瘤空白对照组相比，化疗前7 d运用消岩汤加顺铂组（P＜0.01）、化疗前3 d运用消岩汤加顺铂组的胸腺指数明显高于荷瘤空白对照组（P＜0.05），具有显著性差异。在消岩汤提前介入化疗中可以看出，提前7 d运用中药均较提前3 d及同时用药的胸腺指数升高明显，有显著性差异（P＜0.05）。与荷瘤空白对照组相比，化疗前7 d运用消岩汤加顺铂组、化疗前3 d运用消岩汤加顺铂组的脾脏指数明显高于荷瘤空白对照组，具有显著性差异（P＜0.01）。在消岩汤提前介入化疗中可以看出，提前7 d均较提前3 d运用中药脾脏指数没有显著性差异（P＞0.05）。提前7 d运用消岩汤较同时用药脾脏指数升高，有显著性差异（P＜0.05）。

3.5 IL-2及IFN-γ的变化 如表2所示：各组小鼠血清IL-2具有显著差异（P＜0.01）。单纯化疗组的IL-2水平明显低于荷瘤空白对照组，具有显著性差异（P＜0.05）。与顺铂组相比，化疗前7 d运用消岩汤加顺铂组、化疗前3 d运用消岩汤加顺铂组及消岩汤同时加顺铂组均能显著提高荷瘤小鼠IL-2水平（P＜0.05）；与荷瘤空白对照组相比，化疗前7 d运用消岩汤加顺铂组的IL-2水平明显提高（P＜0.01）。而在消岩汤提前介入化疗中可以看出，提前7 d运用中药较同时用药的IL-2水平升高明显，并具有显著性差异（P＜0.05）。

表2 各组小鼠的胸腺指数、脾脏指数及血清IL-2及IFN-γ的变化情况(±s)Tab.2 Mice spleen index,thymus inde and serum IFN-γ,IL-2 content in serum(±s)

表2 各组小鼠的胸腺指数、脾脏指数及血清IL-2及IFN-γ的变化情况(±s)Tab.2 Mice spleen index,thymus inde and serum IFN-γ,IL-2 content in serum(±s)

注：与单纯化疗组比较，▲P＜0.05；与荷瘤空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别n ABCDEF 101010101010胸腺指数（g/kg）2.069±0.1882.004±0.1321.863±0.1062.447±0.291▲**2.218±0.249▲*2.134±0.157▲脾脏指数（g/kg）8.024±0.2527.850±0.2357.556±0.323*8.445±0.262▲**8.235±0.232▲**8.056±0.192▲IFN-γ（u/L）108.11±9.53101.35±6.1787.25±5.97114.38±5.89▲**106.06±7.43▲*101.72±9.42▲IL-2（u/L）92.80±6.4588.35±6.1778.25±6.6696.38±5.82▲**91.96±6.24▲*84.72±6.86▲

如表2所示：各组小鼠血清IFN-γ具有显著差异（P＜0.01）。单纯化疗组的IFN-γ水平明显低于荷瘤空白对照组，具有显著性差异（P＜0.05）。与顺铂组相比，化疗前7 d运用消岩汤加顺铂组、化疗前3 d运用消岩汤加顺铂组及消岩汤同时加顺铂组均能显著提高荷瘤小鼠IFN-γ水平（P＜0.05）；与荷瘤空白对照组相比，化疗前7 d运用消岩汤加顺铂组的IFN-γ水平明显提高（P＜0.01）。而在消岩汤提前介入化疗中可以看出，提前7 d运用中药较提前3 d运用中药及同时用药的IFN-γ水平升高明显，并具有显著性差异（P＜0.05）。

4 小结

通过动物实验观察，结果显示消岩汤在提高Lewis肺癌小鼠免疫器官及细胞免疫功能方面有良好的效果。本实验结果表明，消岩汤提前介入化疗对Lewis肺癌小鼠有较好的抑瘤作用，生长活动状况也较好，较单纯化疗有显著性差异。单纯化疗小鼠胸腺指数及脾脏指数较荷瘤空白对照组及空白组小鼠低下，化疗前运用消岩汤介入治疗lewis肺癌小鼠胸腺指数及脾脏指数较单纯化疗小鼠升高，具有显著性差异。IL-2、IFN-γ等细胞因子在介导机体抗肿瘤免疫过程中起着重要的作用。实验结果显示单纯化疗组IL-2、IFN-γ细胞因子活性均显著低于正常对照组及荷瘤空白对照组。而在化疗前运用消岩汤配合化疗，IL-2、IFN-γ细胞因子分泌水平显著高于单纯化疗组。其中，提前7 d运用消岩汤配合化疗疗效更好。实验结果提示消岩汤能保护实验动物的细胞免疫器官，提高小鼠的免疫功能。