bFGF对脑缺血再灌注大鼠ICAM-1表达及脑组织含水量的影响

闻公灵 娄季宇 白宏英

1)河南南阳市中心医院神经内科 南阳 473009 2)郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014

研究发现脑缺血再灌注损伤时的炎症反应促进了脑梗死的继发性脑损害。细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule1,ICAM-1)是最重要的白细胞-内皮细胞间黏附分子之一,其在脑缺血再灌注损伤中的作用成为急性缺血性脑卒中研究的热点。本实验将通过观察bFGF对缺血再灌注脑组织中性粒细胞浸润和对ICAM-1表达的检测,探讨bFGF对脑缺血再灌注损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1实验动物分组及给药选择体质量为270～320 g的健康SD大鼠48只,雌雄各半(由河南省实验动物中心提供),随机分成假手术组、缺血再灌注组、bFGF组,每组16只。bFGF为北京双鹭药业股份有限公司研制,用注射用水稀释,bFGF组腹腔注射10μ g/kg,其余组腹腔注射等量生理盐水,缺血后即刻给药。

1.2动物模型制作用体积分数为10%的水合氯醛300 mg/kg麻醉,采用 Longa等[1]的线栓法建立大脑中动脉(MCA)闭塞模型。缺血再灌注组及bFGF组均给予缺血1 h再灌注24 h,届时灌注取脑、固定、脱水、透明、包埋。假手术组除不插线外,余同上。

1.3大鼠脑含水量的测定造模后,快速断头,开颅取脑,取右侧前脑1/4部分称重(湿脑重),然后在 110°C烤箱中烤至恒重,分析天平称重(干脑重),计算脑含水量%=(湿脑重-干脑重)/湿脑重×100%。

1.4脑缺血后脑毛细血管通透性测定每组取8只大鼠,假手术组于尾静注伊文思蓝50 mg/kg,不阻断大脑中动脉,其余两组则在阻断大脑中动脉前5 min由尾静注伊文思蓝50 mg/kg。缺血1 h再灌注24 h后,断头取脑,称重,将脑浸泡于5 mL甲酰胺中,在45°C恒温箱中温育72 h。取温育液,用722型分光光度计在620 nm处测定吸收度,根据标准曲线计算出脑内伊文思蓝的含量(ug/g湿脑重)。

1.5脑缺血大鼠脑组织形态观察每组取8只大鼠,届时灌注取脑、固定、脱水、透明、包埋。HE染色,光镜检查。观察白细胞浸润。

1.6免疫组织化学染色检测ICAM-1 采用SABC法,石蜡切片常规脱蜡至水,过氧化氢封闭,抗原热修复 20 min,血清封闭,滴加1∶100兔抗ICAM-1抗体(购自博士德生物公司),4℃过夜,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate bufferad satine,PBS)洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h,PBS洗,滴加ABC复合物37℃孵育1 h,PBS液洗,DAB显色,镜下控制反应时间,双蒸水终止反应,脱水、透明、封片、显微镜观察。10×40倍光镜下,在缺血区计数5个视野,计数阳性微血管数(血管内皮细胞胞浆、胞膜被染成棕黄色颗粒状),取其均值,以阳性微血管数/高倍视野表示。

1.7统计学处理采用SPSS12.0统计分析软件进行处理,数据以均数±标准差(s)表示,组间比较采用 t检验。取α=0.05作为检验水准,P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1缺血再灌注脑组织含水量的变化及bFGF对其的影响实验结果表明,大鼠缺血1 h再灌注 24 h后,脑组织出现明显水肿,表现为脑缺血再灌注组脑含水量与假手术组比较有明显增加,有显著性差异;而bFGF组脑含水量较缺血再灌注组明显减少,有显著性差异。表明bFGF能够对抗因脑缺血再灌注造成的脑组织水肿现象。结果见表1。

表1 缺血再灌注脑组织含水量的变化及bFGF对其影响 (s)

表1 缺血再灌注脑组织含水量的变化及bFGF对其影响 (s)

与缺血再灌注组比较,△P＜0.05

组 别 n 含水量(%)假手术组 8 75.38±10.71缺血再灌注组 8 84.92±13.58 bFGF组 8 77.81±9.43△

2.2缺血再灌注脑血管通透性的变化及bFGF对其的影响结果表明,与假手术组比较,脑缺血再灌注组大鼠脑血管通透性增加,表现为单位脑组织伊文思蓝含量显著升高bFGF组脑组织中伊文思蓝含量明显减少,使单位脑组织伊文斯蓝含量恢复至正常或接近正常水平,与缺血再灌注组比较有显著性差异。结果见表2。

表2 缺血再灌注脑血管通透性的变化及bFGF对其影响 (s)

表2 缺血再灌注脑血管通透性的变化及bFGF对其影响 (s)

△与缺血再灌注组比较,P＜0.05

组 别 n 伊文斯蓝含量(ug·g-1)假手术组 8 4.01±0.83缺血再灌注组 8 7.51±1.69 bFGF组 8 5.25±2.63△

2.3缺血再灌注脑组织形态学变化及bFGF对其的影响镜下所见,假手术组大鼠脑组织神经细胞形态结构正常;毛细血管腔较窄,神经细胞、毛细血管周围都产生空隙。缺血再灌注组脑组织出现明显的梗死灶,光镜下可见大量神经元变性坏死,间质水肿明显,神经细胞及毛细血管周围空隙增宽。bFGF组多数神经元结构较完整,形态相对正常,间质水肿轻,神经细胞周围无明显的空隙,毛细血管周围的空隙明显减小。

2.4缺血再灌注脑组织ICAM-1阳性表达血管的变化及bFGF对其的影响假手术组未观察到ICAM-1阳性微血管,缺血再灌注组可见较多ICAM-1阳性微血管,在脑组织切片中ICAM-1免疫阳性染色可见于微血管的内皮细胞上,明显的免疫阳性染色出现在缺血再灌注侧半球,并主要局限于缺血区。bFGF组ICAM-1阳性微血管数较缺血再灌注组明显减少(P＜0.05),见表 3。

表3 缺血再灌注脑组织ICAM-1阳性表达血管变化及bFGF对其影响 (s)

表3 缺血再灌注脑组织ICAM-1阳性表达血管变化及bFGF对其影响 (s)

与缺血再灌注组比较,△P＜0.05

组 别 n ICAM-1假手术组 8 ——缺血再灌注组 8 24.41±5.33 bFGF组 8 19.53±5.07△

3 讨论

脑缺血再灌注时,缺血灶内聚集较多细胞因子及黏附分子,造成白细胞大量聚集,阻塞微血管,并释放大量的炎性介质,脑组织水肿明显。脑组织含水量能反映脑水肿的程度。检测脑组织中伊文氏蓝含量的高低可反映血脑屏障通透性变化的程度[2]。本实验采用bFGF干预大鼠缺血1 h再灌注24 h,测量各组脑组织含水量、毛细血管通透性变化情况,结果显示缺血再灌注组的脑组织含水量、脑血管通透性明显增加。

脑缺血再灌注后脑水肿加重的原因是多方面的,其中白细胞与血管内皮细胞的牢固黏附及其后所产生一系列的病理反应[3],是脑缺血再灌注后血脑屏障破坏和脑水肿发生的重要原因之一。ICAM-1在白细胞与血管内皮细胞的牢固黏附过程中起重要作用。本实验观察到,在损伤区皮质,假手术组未见ICAM-1阳性微血管,缺血再灌注组可见较多的ICAM-1阳性微血管,在病灶区及半暗带区均可见到。应用HE染色观察缺血区脑组织病理变化情况,结果显示假手术组大鼠脑组织神经细胞形态结构正常,毛细血管腔较窄,神经细胞、毛细血管周围都产生空隙。大鼠MCAO 1 h再灌注24 h后,脑组织出现明显的梗死灶,光镜下可见大量神经元变性坏死,呈现胞体皱缩、变形、核固缩,胞浆浓缩呈深伊红染色,神经细胞及毛细血管周围空隙增宽,神经胶质细胞明显肿胀,间质疏松、水肿。

bFGF是一种重要的神经营养因子,广泛分布于成熟和未成熟的中枢神经系统内,通过与其相应受体结合发挥神经保护作用。当脑组织受到各种损伤时,外源性bFGF能通过受损的血脑屏障发挥其神经保护作用[4]。本实验显示缺血即刻给予bFGF,脑组织含水量明显减少,毛细血管通透性下降。bFGF组多数神经元结构较完整,形态相对正常,间质水肿轻,神经细胞周围无明显的空隙,毛细血管周围的空隙明显减小。免疫组化法检测ICAM-1显示缺血区虽仍有较多ICAM-1阳性微血管,但较缺血再灌注组相比明显下降,表明bFGF可抑制缺血再灌注后脑组织ICAM-1的表达,降低血管通透性,减轻缺血区脑组织水肿。其作用机制目前尚不清楚,有待进一步研究。

[1]Longa EZ,Weinsein P R,Canson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion withcraniectony in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]史保中.脑出血的评价指标及其研究进展[J].国外医学·神经病学神经外科学分册,2002,29(3):207-209.

[3]姜亚军,何家声,丁德云.脑缺血再灌注期间白细胞黏附机制的研究进展[J].国外医学脑血管疾病分册,1996,4(5):261-263.

[4]Rothlein R,M ainolfi EA,Czajkowski M.A form of circulating ICAM-1 in human serum[J].J Immunol,1991,147(11):3 788-3 793.