慢性乙型肝炎病毒感染者H B V基因分型研究

吕洛堂 黄华健 张 丹

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。长链为负链，位置和长度相对固定。短链为正链，其长度可变，约为负链的50%～80%。HBV主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌，其基因序列高度变异。1988年Okamoto等[1]根据不同基因型之间的差异＞8%，将HBV DNA分为A～D4型，初步建立了乙型肝炎病毒基因分型标准。Naito等[2]基于HBV preS1至S基因建立了型特异性引物PCR分型法，该方法可以精确地确定A～F六个HBV基因型，不仅特异性高，而且快捷、方便。既往流行病学调查表明HBV基因型呈一定的地理区域分布[3-5]。湖南邵阳地区HBV基因型分布如何，有待于研究。

1 材料与方法

1.1 标本来源 168例慢性HBV感染者为湖南省邵阳市中心医院和新宁县回龙镇中心卫生院门诊和住院患者，其中慢性无症状HBV携带者(chronic asymptomatic HBV carrier，AsC)79例、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)68例、肝硬化(liver Cirrhosis，LC)21例。男105例，女63例，年龄13～76岁，诊断标准符合2000年第十次全国传染病与寄生虫病学会和肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案。所有患者均排除了丙型肝炎病毒感染及其他能导致肝脏病变的疾病。所有血清标本经检测HBV血清学标志物后，贮存于-70℃待检。

1.2 主要试剂 血清DNA抽提试剂盒，购自上海科华生物科技有限公司；PCR扩增试剂(2×pfu MasterMix)、D2000 Marker购自北京天根生物科技有限公司。

1.3 血清DNA提取 按试剂盒说明书进行，采用浓缩裂解法，稍做改动。操作步骤简述如下：取50μL浓缩液加到0.5mL离心管中，再加入待测血清50μL，振荡混匀后静置2min，8000转/min离心5min，弃上清。加入10μL裂解液，剧烈振荡至无沉淀后短暂离心，沸水浴10min，14000转/min离心15min，取上清液2μL为模板做PCR反应。

1.4 HBV基因型的检测 采用型特异性引物分型法。按照文献[6]介绍的方法进行。引物序列见表1，由上海生工生物科技有限公司合成。首先用外引物P1与P2进行第一轮PCR，反应体系为：引物P1(10μm)和P2(10μm)各0.5μL，2×Pfu MasterMix 12.5μL，模板1μL，ddH2O 10.5μL，总体积25μL。将上述组分混匀后，加40μL石蜡油覆盖液面。扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环后72℃再延伸5min。同时以ddH2O作为阴性对照。然后以第一轮PCR产物为模板，分别以A组引物(B2、BA1R、BB1R、BC1R)和B组引物(B2R、BD1、BE1、BF1)为内引物进行第二轮PCR，检测HBV基因型A、B、C和D、E、F。PCR反应体系中除引物外，其余成分同第一轮，同时以ddH2O作为阴性对照。扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环后72℃再延伸10min。最后将两组第二轮PCR产物分别在30g/L琼脂糖中进行电泳，同时加入分子量Marker(D2000)，在紫外光下通过PCR扩增产物片段的大小来判断基因型。

1.5 统计学分析 两个样本构成比的比较采用x2检验，P 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对邵阳地区168例不同临床类型的慢性HBV感染者进行基因分型，可检出B型、C型、混合型B+C和混合型B+D，分别占51.2%、42.2%、5.4%和1.2%，未发现A型、E型和F型。各临床类型HBV基因型构成比见表2。慢性无症状HBV携带者与慢性乙型肝炎相比，HBV基因型构成比无显著性差异(x2＝0.12，P＞0.05)。肝硬化患者HBV基因型与慢性无症状HBV携带者或慢性乙型肝炎相比，C基因型所占比例较高，经统计学处理，两组之间基因型构成比无显著性差异(x2＝4.63或3.61，P＞0.05)。

表1 巢式PCR HBV基因分型所用引物序列

表2 168例慢性HBV感染者血清HBV基因型分布[例(%)]

3 讨论

我国属HBV感染高流行区，流行病学调查表明HBV基因型呈一定的地理区域分布。在我国，HBV基因型主要是B型和C型， 但二者的分布也存在一定的地域差异[7-11]，南方以B型为主，北方以C型为主；A型和D型在多数地区也占有一定比例，目前尚未发现E型和F型。目前认为，不同地区优势基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点，是病毒变异后进化的结果。肖扬等[7]对浙江温州地区966例患者进行HBV基因分型发现，66.46%为C型，20.49%为B型，11.08%为混合型B+C。高俊薇等[12]对北京、长春、汉川、深圳、清远和南京等11个城市的1214例HBV DNA阳性的慢性HBV感染者进行研究发现，0.7%为A型，58.4%为C型，28.4%为B型，12.4%为混合型B+C，未发现有D、E、F型。北方地区(长春、北京、石家庄)慢性HBV感染者中C基因型比较高，分别为58.2%、67.5%和63.6%，山东省聊城和济南市的C基因型高达90.2%和87.9%。随着地理位置南移，B基因型的比例逐渐增高，广东省清远和深圳市的B基因型比例分别为7.14%和63.6%。本研究慢性HBV感染者血清中，B型占51.2%，C型占42.2%，混合型B+C占5.4%，混合型B+D占1.2%，未发现A型、E型和F型。表明湖南邵阳HBV基因型仍以B型和C型为主。

目前研究发现，HBV基因型与临床表现、预后、治疗应答均有一定关系，不同基因型具有不同的致病性。Kao等[13]的研究结果提示，随着疾病严重程度的增加，C型所占的比例升高，而B型所占比例降低，C型与较为严重的肝脏疾病有关。本研究表明，肝硬化患者主要以C型感染为主、其次为B型。C基因型在肝硬化患者中所占的比例较高，但与慢性无症状HBV携带者或慢性乙型肝炎相比，差异无统计学意义。

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