P糖蛋白在骨肉瘤中的表达及其临床意义

张世权 肖德明 关弘 李伟 谭纪锋 朱玉华

大剂量新辅助化疗的开展使骨肉瘤的治疗取得了突破性进展。近10余年来，骨肉瘤的治疗似乎进入了一个平台期，其生存率难以进一步提高，原因之一可能与多药耐药基因(MDR)有关。我们应用免疫组织化学染色方法，检测MDR产物P糖蛋白(p-gp)在36例骨肉瘤组织的表达，旨在探讨骨肉瘤p-gp表达与骨肉瘤临床预后的的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 36例骨肉瘤标本均为我院活检或手术切除后经石蜡包埋存档的组织并经病理学确诊，其中男19例，女17例，年龄平均19.9岁。Enneking分期ⅡA3例，ⅡB27例，ⅢB6例，并发病理性骨折7例。所有病例手术时均未发现远处转移灶，取材前均未接受过放疗和细胞毒性药物治疗。17例骨软骨瘤均为少数切除后经石蜡包埋存档的组织并经病理学确诊。随访结果：36例骨肉瘤随访时间平均3.5a，其中存活3a及以上者13例，存活3a以下者23例，死亡病例均因骨肉瘤远处转移全身衰竭致死。

1.2 p-gp检测方法 选择含肿瘤细胞丰富切片之对应的石蜡包埋标本，常规经5μm厚连续切片，行链菌素亲生物素-过氧化物酶法(S-P法)免疫组化染色，所有试剂均购自福州迈新公司,技术操作按规定程序进行。以PBS液代替一抗作为空白对照。

1.3 结果判定与统计学处理 油镜(×100)下观察p-gp染色分布于细胞膜和浆中，呈棕褐色颗粒状，并为片状或灶状分布。每张切片观察10个高倍镜视野，取其平均数，阳性细胞数小于5%为阴性，大于5%为阳性。每份标本同时作 HE染色，行常规病理学检查。统计学处理：不同组间p-gp表达结果统计学处理采用x2检验。

2 结果

36例骨肉瘤随访时间平均3.5a，其中存活3a及以上者13例，存活3a以下者23例，死亡病例均因骨肉瘤远处转移全身衰竭致死。36例骨肉瘤p-gp阳性表达率为50.0%，显著高于骨软骨瘤组，有显著性差异(P＜0.01)。p-gp表达在不同Enneking外科分期组间无显著性差异(P＞0.05)，在生存时间3a及以上组及3a以下组间有显著性差异(P＜0.01)。见表1～3。

3 讨论

P糖蛋白(p-gp)是多药耐药基因(MDR)编码的蛋白质，它在多种人类恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、大肠癌及肝癌中均有较高表达。目前有关骨肉瘤细胞MDR基因p-gp表达的研究尚不多，但已有证据表明骨肉瘤常表现出p-gp高表达[1]。Stein等[2]用PCR技术证实9例骨肉瘤中的7例有MDR基因的异常。Wunder等[3]的研究发现15例骨肉瘤患者的18个标本均有不同程度的MDR表达。Kandel[4]应用免疫组化技术的研究表明10例骨肉瘤中有50%为p-gp表达阳性。本组应用免疫组化的方法，对MDR基因所编码的p-gp在骨肉瘤组织中的表达进行了测定，结果发现在36例中，18例为阳性表达，阳性表达率为50.0%，显著高于作为对照的骨软骨瘤组，有显著性差异(P＜0.01)，提示p-gp表达可能与骨肉瘤作为高度恶性肿瘤的生物学行为有关。关于P糖蛋白表达对骨肉瘤预后影响的研究，目前结论尚不一致。Wunder[3]在对一组骨肉瘤患者30个月的随访结果中发现MDR高水平表达的患者预后较差。Peabody等[5]在评价影响骨肉瘤患者预后因素时提出多药耐药基因及其产物p-gp的表达是一重要因素。郭伟[6]在对67例恶性骨肿瘤的(其中骨肉瘤20例)p-gp表达的免疫组化研究中发现：尽管p-gp阳性组的2a及5a生存率较阴性组低，但无显著性差异。沈靖南[7]采用免疫组化LSAB法，检测84例骨肉瘤中p-gp表达，半定量化计量p-gp的着色强度及阳性率，发现骨肉瘤p-gp表达的阳性率为55.1%，p-gp阳性表达中的65.2%为低表达，认为骨肉瘤组织分主流细胞群和稀有细胞群，它们表达p-gp有不同的预后价值：主流细胞群表达p-gp，体现于p-gp的表达量和范围，早期发生肺转移，预后不良；稀有细胞群表达p-gp的临床意义取决于着色强度。高水平表达，肺转移早，预后不良，而低水平表达，肺转移迟，预后好于前者。Serra等[8]用半定量免疫荧光法检测105例骨肉瘤，其中38例经随访2a发现：p-gp过度表达与高转移率、预后不良有关。本研究结果显示p-gp蛋白表达在不同Enneking外科分期组间无显著性差异(P＞0.05)，在生存时间3a及以上组及3a以下组间有显著性差异(P＜0.01)，生存3a以下的患者其p-gp表达阳性率明显高于3a及以上的患者，表明p-gp表达对骨肉瘤患者的预后评估具有一定价值，p-gp阳性表达的骨肉瘤患者预后较差。当然，影响骨肉瘤预后的因素十分复杂，已有的证据证明与病理分型、外科分期、肿瘤大小、起病缓急、有无病理性骨折、碱性磷酸酶水平以及是否进行规范大剂量化疗等多种因素有关。有关P53蛋白表达在骨肉瘤预后评估中的作用，有必要进一步进行大样本研究和统计学分析。

表1 骨肉瘤与骨软骨瘤的p-gp表达(例)

表2 骨肉瘤不同Enneking分期的p-gp表达(例)

表3 骨肉瘤不同预后的p-gp表达(例)

[1]应明.骨肉瘤多药耐药性及其逆转[J].中华骨科杂志,1997,17(7)：461-463.

[2]Stein U,Walther W,Wanderlich V.Point mutations in the mdrl promoter of human osteosarcomas are associated with in vitro resposiveness to multidrug resistance relevant drugs[J].Eur J Cancer(Am),1994,30：1541-1548.

[3]Wunder JS,Bell RS,Wold L,et al.Expression of the multidrug resistance gene in osteosarcoma：a piolt study[J].J Orthop Res,1992,11：396-402.

[4]Kandel RA,Campbell S,Noble TS,et al.Correlation of P-glycoprotein detection by immunohistochemistry with mdrl mRNA level in osteosarcoma：piolt study[J].Diagn Mol Pathol,1995,4：59-65.

[5]Peabody TD,GibbS CP,Simon MA.Evalution and staging of musculoskeletal neoplasms[J].J Bone Joint Surg,1998,80(A)：1204-1218.

[6]郭伟,肖颖,盛传家,等.P170和PCNA在恶性骨肿瘤中的表达[J].中华骨科杂志,1998,18：423-425.

[7]沈靖南,王晋,韩士英,等.骨肉瘤p-糖蛋白表达水平与肺转移[J].中华骨科杂志,2000,20：21-24.

[8]Serra M,Scotlandi K,Manara MC,et al.Analysis of P-glycoprotein expression in osteosarcoma[J].Eur J Cancer (Am),1995,31：1998-2002.