枸杞多糖对诱导树突状细胞成熟和增强T细胞增殖的影响

张纯清，单铁英，杨书良，袁 征

（河北工程大学医学院：1.人体解剖学与组织胚胎学系；2.病理学系；3.生理学系，邯郸056002）

枸杞多糖（lycium bararum polysaccharides，LBPs）是传统中药材枸杞的主要成分之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6种单糖组成。近年来对LBPs的药理作用进行了广泛的研究，发现LBPs具有调节机体免疫、抗肿瘤等功能［1－4］。LBPs的研究已成为当前热门课题，但国内外还未见LBPs对人树突状细胞（dendritic cell，DC）成熟和功能影响的报道。本研究观察LBPs诱导DC成熟和增强T细胞增殖作用，研究其具体作用机制，为进一步研究LBPs调节特异性免疫应答机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 新鲜人外周血购自北京市血库，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂，rhGM－CSF、rhIL－2和rhIL－4购自德国R＆D公司，尼龙毛购自FENWAL USA，鼠抗人 MHCⅡ、CD86、CD83即用型二步法生物素检测试剂盒（PV9000），FITC标记二抗购自北京中山生物技术有限公司，LBPs购自美国泛华公司。

1.2实验方法

1.2.1DC诱导培养 取正常人外周血200mL，以淋巴细胞分离液分离单个核细胞于培养皿培养2h后，取贴壁细胞即单核细胞，加 入 GM－CSF 1mL（1 000u/mL）、IL－4 1mL（500 u/mL）培养7d后，收获的细胞加入终浓度为100μg/mL的LBPs，加入等量RPMI 1640作为对照；37℃培养48h后收集细胞。观察DC形态变化。

1.2.2免疫细胞化学法检测DC分子表达 取固定好的DC细胞涂片，DC纯度为90%。用3%H2O2甲醇溶液室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化酶。蒸馏水冲洗，0.01MPBS（pH 7.3）浸洗3次，每次5min。0.1%Triton X－100室温孵育5min。0.01MPBS（pH 7.3）浸洗3次，每次5min。滴加一抗（鼠抗人 MHCⅡ、CD86、CD83抗体），反应1h后，0.01M PBS（pH7.3）浸洗3次，每次5min。滴加PV9000试剂盒内试剂1，37℃孵育10～30min。用0.01MPBS（pH 7.3）浸洗3次，每次5min。滴加PV9000试剂盒内试剂2，37℃孵育10～30min。用0.01MPBS（pH 7.3）浸洗3次，每次5min。滴加0.05MTris－HCl（pH 7.6）浸泡5min。DAB显色，显色时间5～10min。用自来水充分冲洗，复染核后，脱水、透明、封片、光镜观察。

1.2.3T细胞的获得 取同种异体外周血，按以上方法获得单个核细胞于培养皿培养2h后，收集非贴壁细胞即为淋巴细胞，将3×107个/mL淋巴细胞注入尼龙毛柱，放入培养箱静置1h。用培养液洗柱，洗下的即为T细胞。

1.2.4T细胞的激活和增殖 调节按以上方法获得的T细胞浓度为2×105个/100μL，以每孔100μL加入96孔板，作为反应细胞。收集按以上方法获得的两组DC作为刺激细胞。调整DC浓度为2×103、1×104、2×104个/孔，分别与T细胞混合，总体积为每孔200μL，每组设5个复孔。培养120h，于最后18h加入10μL MTT（5mg/mL）离心，弃上清液，加入150μL二甲基亚砜（DMSO）。用酶标仪检测OD值，并计算细胞增殖指数。增殖指数＝（实验组OD值－反应细胞对照组OD值－刺激细胞对照组OD值）/反应细胞对照组OD值。

1.3统计学方法 所得数据用SPSS11.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析，实验结果以s表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1DC的体外诱导与培养 在倒置相差显微镜下可见正常人外周血分离的单核细胞在培养过程中体积逐渐增大，细胞形态由圆形变为逗点状、蝌蚪状、长梭形或不规则形，并向四周伸出不规则状的突起。经LBPs作用的DC呈悬浮状生长，体积较大，大小不等，呈圆形，细胞表面有突起且在培养液中可摆动或伸缩。而经RPMI 1640培养的DC对照组与培养前无明显变化。

2.2LBPs对DC MHCⅡ、CD86、CD83等分子表达的影响经LBPs诱导培养的DC分子表达有明显变化（MHCⅡ＋、CD86＋、CD83＋），而经RPMI 1640培养的DC分子表达与培养前变化不明显（表1）。

表1 两组培养2d后DC分子表达的图像分析结果（s）

表1 两组培养2d后DC分子表达的图像分析结果（s）

分子表达 实验组 MOD（n＝20）对照组MOD（n＝20）P 0.05 CD86 0.186 0±0.004 6 0.012 8±0.003 2 ＜0.05 CD83 0.192 6±0.003 8 0.025 3±0.001 9 ＜0.05 MHCⅡ 0.287 4±0.014 5 0.027 9±0.016 3 ＜

2.3T细胞增殖实验结果 培养液中有LBPs时DC激发T细胞增殖的能力进一步增强（P＜0.05），且在此浓度范围内随着DC浓度增加T细胞增殖指数也增加（表2）。

表2 T细胞增殖指数（s，n＝10）

表2 T细胞增殖指数（s，n＝10）

DC浓度 实验组 对照组P 2×103 0.362±0.019 0.213±0.011 ＜0.05 1×104 0.486±0.018 0.296±0.013 ＜0.05 2×104 0.667±0.014 0.412±0.009 ＜0.05

3 讨 论

肿瘤患者在接受放、化疗时，射线和药物对机体的免疫系统有抑制作用，致使机体的免疫功能进一步下降，影响了治疗效果并可导致一些不良反应，所以解决肿瘤患者免疫功能低下问题成为肿瘤治疗非常关键的环节。最近国内外学者提出生物反应调节剂（biological responsemodifier，BRM）的概念，强调在肿瘤放、化疗及手术治疗的同时应用BRM，不但能提高患者的免疫功能，还可减轻上述治疗对免疫系统及造血系统的损害，从而提高治疗效果。在我国中药取自天然，来源广泛，容易获得，不良反应小。因此从中药中提取有效成分作为BRM显示其明显优势。为此作者对LBPs免疫调节作用进行了研究，显示了很好的免疫促进作用，为进一步研究其作用机制，作者进一步研究了LBPs对外周血巨噬细胞增殖及功能的影响。

LBPs已经很多实验证明具有调节免疫功能和抗肿瘤的功能。已有文献报道了TBPs对巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞的影响［2］，但对DC的表型和功能的影响却未见报道。

DC是一种重要的专职抗原提呈细胞，对启动辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的免疫应答具有重要作用［3－5］。imDC俘获和处理外源性抗原后成为mDC，通过主要组织相容性复合物（MHC）分子提呈抗原多肽激活T细胞，启动特异性免疫应答。有实验证明，DC的成熟状态与其功能有关，imDC有较强的抗原摄取和加工能力［6－10］。MHCⅡ、CD86、CD83分子是与DC抗原提呈作用密切相关的分子，也是与DC对T细胞的激活作用密切相关的分子。本实验结果显示，经过LBPs刺激作用后的DC，MHCⅡ、CD86、CD83的表达水平明显增高，且DC激活T细胞能力及T细胞增殖能力增强，说明LBPs能诱导DC成熟，同时刺激T细胞增殖能力增强。

本实验从DC形态、表面抗原、抗原提呈功能方面显示了LBPs对人DC成熟的影响。LBPs促进DC成熟的机制是什么、是否与多糖的种类、结构、剂量有关等尚有待进一步研究。

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