血管内皮生长因子在门静脉高压大鼠腹水形成中的作用＊

赵永忠，漆志平，周英琼，霍 群，韦铮武，侯巧燕

（桂林医学院：1.附属医院消化内科；2.硕士研究生；3.附属医院病理科，541001；4.生化教研室 541004）

腹水是肝硬化患者最突出的临床表现，同时也是提示肝硬化患者预后不良的因素之一。门静脉高压、低清蛋白血症及肾功能不全常是引起肝硬化患者腹水形成的主要原因。新近研究表明，门静脉高压在肝硬化腹水形成中起主导作用［1］。然而门静脉高压导致腹水形成的原因尚未彻底阐明。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前发现的最强的增强血管通透性的物质之一，又是血管发育、成熟的病理生理过程中最重要的血管生成因子。作者以前的研究表明，VEGF在门静脉高压大鼠模型中胃组织的表达是增高的［2］。本研究中作者利用渗透性改变复制门静脉高压大鼠腹水模型，同时进一步探讨门静脉高压状态下VEGF与腹水形成的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 56只成年雄性SD大鼠，由日本福冈大学医学部实验动物中心提供，体质量220～240g。随机分为3组：门静脉结扎（portal vein ligation，PVL）组32只，假手术（sham－operated，SO）组16只，门静脉结扎联合沙利度安（thalidomide）治疗（PVL－T）组8只。

1.2门静脉高压腹水模型制备 参照参考文献［3］制作门静脉高压模型：实验前24h禁食，自由饮水，予5%戊巴比妥钠溶液0.11～0.13mL/100g体质量腹腔内注射麻醉；开腹后暴露并游离门静脉主干，沿其纵轴外置一根20G钝性针头，于近肝门处用3－0丝线结扎门静脉主干及外置针头后拔针，形成肝前性门静脉狭窄；假手术组仅游离门静脉主干而不结扎，其余步骤同PVL组。于术后第1、3、5、7天分别处死PVL组8只和SO组4只。为复制大鼠腹水模型，作者给每只大鼠腹腔注射33.33%葡萄糖溶液1mL，30min后收集腹水和肠系膜组织标本进行VEGF测定。

1.3检测项目与方法

1.3.1收集腹水总量与腹水中VEGF含量测定 麻醉大鼠后开腹，收集所得腹水减去注入的葡萄糖1mL即为腹水总量。采用ELISA法测定腹水中VEGF含量，严格按试剂盒说明书操作（VEGF试剂盒购自美国R＆D公司）。

1.3.2门静脉压力测定 采用与造模相同的方法打开腹腔，稳定10min后用20G套管针穿刺肠系膜上静脉近端，退出针芯并将套管送至门静脉结扎远端，将该处所测得的压力代表门静脉压力；SO组因无粘连可直接穿刺门静脉测压，套管针另一端接压力传感器（型号为TSD104A），传感器将采集到的压力信号转换成数字信号后输入计算机，采用MP－2100型多道生理记录仪测定门静脉压力（美国BIOPAC公司制造），单位以mm Hg表示。

1.3.3组织学检查 处死大鼠后剪取少许肠系膜组织，经10%中性福尔马林溶液固定后，常规石蜡包埋、切片（约4 μm），HE染色，光镜下观察肠系膜组织学改变。

1.3.4肠系膜组织VEGF免疫组化染色 处死大鼠后剪取少许肠系膜组织，经10%中性福尔马林溶液固定24h后，脱水作石蜡包埋、切片（约4μm），采用免疫组化SABC法（兔抗人多克隆VEGF抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司）检测肠系膜组织中VEGF表达情况（严格按试剂盒说明书操作），PBS代替一抗做阴性对照。

1.3.5实时RT－PCR检测肠系膜组织VEGF mRNA表达

1.3.5.1提取总RNA 采用Trizol裂解抽提法提取术后3d各组大鼠肠系膜组织总RNA（试剂盒购自美国Ambion公司），严格按试剂盒说明书操作。

1.3.5.2逆转录合成cDNA 采用ASTEC温控系统（Pc818，日本）进行cDNA合成（cDNA逆转录试剂盒购自美国A＆B公司），总体积20μL，25℃、10min，37℃、120min，85℃、5s。

1.3.5.3PCR扩增 应用7500Fast实时荧光定量PCR仪（美国A＆B公司）进行扩增。扩增条件：置PCR仪95℃、20 s，以后95℃、3s，62℃、30s，共40循环，34min扩增产物片段为645bp。采用磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参照。VEGF的上、下游引物和探针分别为：5′－AGTGGTCCCAGGCTGCAC－3′，5′－TCCATGAACTTCACCACTTCGT－3′，5′－（FAM）ATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCA （TAMRA）－3′。GAPDH 的上、下游引物和探针分别为：5′－TGGGTGTGAACCACGAGAA－3′，5′－GGCATGGACTGTGGTCATGA－3′和5′－CTGCACCACCAACTGCTTAGC－3′，其中探针于5′端标记荧光发光基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA。通过标准曲线精确计算样品循环阈值（Ct值）的比值（任意单位）。

1.3.6沙利度安治疗门静脉高压腹水疗效观测 为阻断VEGF活性，PVL－T组大鼠术后连续3d给予沙利度安（美国Sigma公司）腹腔注射（100mg/kg），术后第4天给每只大鼠腹腔注射33.33%葡萄糖溶液1mL，30min后收集腹水和肠系膜组织待检。

1.4统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件处理，各组数据以s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PVL组与SO组大鼠门静脉压力变化 见表1。

表1 PVL组与SO组大鼠术后门静脉压力变化比较（mm Hg，s）

表1 PVL组与SO组大鼠术后门静脉压力变化比较（mm Hg，s）

与SO组比较，＊：P＜0.05。

组别 第1天 第3天 第5天 第7天PVL组 15.83±0.86＊16.91±0.96＊16.73±1.29＊16.39±1.62＊5.83±0.51 5.92±0.76 6.17±0.89 5.90±0.68 SO组

2.2腹水总量及腹水中VEGF含量 术后第1、3天PVL组与SO组大鼠腹水总量及腹水中VEGF含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而术后第5、7天PVL组与SO组大鼠腹水总量及腹水中VEGF含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、3。

表2 PVL组与SO组大鼠术后腹水总量比较（mL，s）

表2 PVL组与SO组大鼠术后腹水总量比较（mL，s）

与SO组比较，＊：P＜0.05，＃：P＞0.05。

组别 第1天 第3天 第5天 第7天PVL组 4.83±1.53＊ 4.92±1.53＊ 4.17±0.29＃ 3.83±0.28＃SO组3.27±0.46 3.40±0.42 3.33±0.28 3.67±0.29

表3 PVL组与SO组大鼠术后腹水VEGF含量比较（pg/mL，s）

表3 PVL组与SO组大鼠术后腹水VEGF含量比较（pg/mL，s）

与SO组比较，＊：P＜0.05，＃：P＞0.05。

组别 第1天 第3天 第5天 第7天PVL组 104.0±41.2＊ 226.1±132.2＊ 64.6±2.1＃ 62.2±22.9＃SO组42.6±4.1 62.4±16.7 60.2±17.9 45.6±10.2

2.3肠系膜组织学改变及VEGF免疫组化染色 PVL组大鼠肠系膜可见毛细血管和小静脉明显扩张、扭曲和变形；而SO组缺如，见插页Ⅱ图1。PVL组大鼠肠系膜VEGF染色呈强阳性，而SO组则呈弱阳性，两组均在血管内皮细胞胞浆中表达，见插页Ⅱ图2。

图1 PVL组与SO组肠系膜组织学改变（HE染色，×100）

图2 PVL组与SO组VEGF免疫组化染色（×400）

2.4肠系膜组织VEGF mRNA表达 术后第3天PVL组大鼠肠系膜组织VEGF mRNA表达明显高于SO组（分别为1.32±0.58、0.43±0.35，P＜0.05）；而 PVL－T组大鼠肠系膜组织VEGF mRNA表达明显低于PVL组（分别为0.28±0.08、1.32±0.58，P＜0.05）。

2.5沙利度安腹腔注射后腹水改变 连续注射3d沙利度安后，PVL－T组大鼠腹水总量明显小于PVL组［分别为（3.4±0.27）mL、（4.92±1.53）mL，P＜0.05］。

3 讨 论

迄今为止，针对肝硬化患者顽固性腹水的治疗仍缺乏有效措施。再者缺乏复制肝硬化腹水的有效动物模型，故作者试图通过部分门静脉结扎复制出大鼠门静脉高压模型后，再采用腹腔注射高渗葡萄糖诱导大鼠腹水形成。

本研究发现，门静脉结扎后第1、3天腹水形成总量和腹水中VEGF含量均较SO组明显增高（P＜0.05）；然而，门静脉结扎后第5、7天腹水形成总量和腹水中VEGF含量与SO组比较，差异无统计学意义。并且门静脉结扎后第3天腹水形成总量和腹水中VEGF含量达最高值，换言之，腹水VEGF含量与腹水形成总量呈正相关，提示VEGF增高后可能通过增加血管通透性促进腹水形成。

免疫组化结果表明，PVL组大鼠肠系膜VEGF染色呈强阳性，而SO组则呈弱阳性，两组主要在血管内皮细胞胞浆中表达。由于在预实验中，作者观察到术后第3天大鼠腹水形成总量和腹水VEGF含量最高，故只选择术后第3天大鼠肠系膜作VEGF mRNA分析。结果表明，术后第3天PVL组大鼠肠系膜组织VEGF mRNA表达明显高于SO组，与Geerts等［4］研究结果一致。国外学者通过复制门静脉高压小鼠模型也得出了同样结果［5－6］。业已证实，VEGF是强有力的血管生成因子，可以引起血管内皮细胞分裂增生并形成新生血管，减少细胞凋亡，促进细胞增生，对不同器官损伤均起到一定保护作用［7－8］。但研究发现VEGF促血管再生的同时亦可使血管通透性增高，导致液体渗出增加。

有资料表明，沙利度安通过降低TNF2α而下调VEGF表达，通过产生氢氧基等发挥抗血管新生作用［9－11］。本研究结果显示，采用沙利度安腹腔注射3d后大鼠腹水形成总量与PVL组相比明显减少；同时肠系膜组织VEGF mRNA表达亦明显降低。作者推测沙利度安可能通过下调VEGF表达来减少腹水形成。Lopez－Talavera等［12］研究显示沙利度安可改善门静脉高压大鼠高动力内脏循环状态，并可降低门静脉压力。

综上所述，门静脉高压可增加由于渗透性改变所致大鼠腹水形成，VEGF高表达可能与大鼠腹水形成有关，抑制VEGF的活性可能是治疗肝硬化患者顽固性腹水的一种新的治疗策略。

（衷心感谢日本福冈大学医学部消化内科向坂彰太郎教授对本文的大力支持和帮助）

［1］Moore KP，Aithal GP.Guidelines on the management of ascites in cirrhosis［J］.Gut，2006，55（Suppl 6）：S1.

［2］赵永忠，王波，王天才，等.血管内皮生长因子在大鼠门脉高压胃病中的作用初探［J］，中华消化杂志，2003，23（3）：189.

［3］Groszmann RJ，Vorobioff J，Riley E.Splanchnic hemodynamics in portal－hypertensive rats：measurement with gamma－labeled microspheres［J］.Am J Physiol，1982，242（2）：156.

［4］Geerts AM，De Vriese AS，Vanheule E，et al.Increased angiogenesis and permeability in the mesenteric microvasculature of rats with cirrhosis and portal hypertension：an in vivo study［J］.Liver Int，2006，26（7）：889.

［5］Fernandez M，Vizzutti F，Garcia－Pagan JC，et al.Anti－VEGF receptor－2monoclonal antibody prevents portalsystemic collateral vessel formation in portal hypertensive mice［J］.Gastroenterology，2004，126（3）：886.

［6］Fernandez M，Mejias M，Angermayr B，et al.Inhibition of VEGF receptor－2decreases the development of hyperdynamic splanchnic circulation and portal－systemic collateral vessels in portal hypertensive rats［J］.J Hepatol，2005，43（1）：98.

［7］董晓灵，王曙光，张玉君，等.VEGF对大鼠50%减体积肝脏移植术后肝再生的影响［J］，重庆医学，2008，37（9）：959.

［8］郎明健，曾秋棠，陈波，等.VEGF基因转染乳鼠心肌细胞移植治疗心梗的研究［J］，重庆医学，2005，34（11）：1669.

［9］Gupta D，Treon SP，Shima Y，et al.Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion：therapeutic applications［J］.Leukemia，2001，15：1950.

［10］Sauer H，Gunther J，Hescheler J，et al.Thalidomide inhibits angiogenesis in embryoid bodies by the generation of hydroxyl radicals［J］.Am J Pathol，2000，156（1）：151.

［11］Andr′e L M，Darid RF，Bronya S，et al.Thalidomide and at halidomide analogue inhibit endot helial cell proliferation in vit ro［J］.J Neuro Oncol，1999，43（2）：109.

［12］Lopez－Talavera JC，Cadelina G，Olchowski J，et al.Thalidomide inhibits tumor necrosis factors alpha，decreases nitric oxide synthesis，and ameliorates the hyperdynamic circulatory syndrome in portal－hypertensive rats［J］.Hepatology，1996，23：1616.