在海藻酸钠凝胶上诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的研究＊

胡 帅，王 嫣△，陈小菊，周 兰，陈文直

（1.重庆医科大学生物医学工程系超声医学工程/重庆市市级重点实验室 400016；2.重庆医科大学护理学院 400016；3.重庆医科大学检验系 400016）

种子细胞的来源及如何为组织工程化器官提供血供是目前血管组织工程面临的两大关键问题［1］。血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VEC）作为血管组织的种子细胞是组织工程化血管的核心，是血管外科和心脏外科血管移植物的主要材料，但其来源较困难，自体细胞不易获取，体外扩增能力有限，异体细胞存在免疫原性而较难应用。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）获取容易，来源广泛，且具有多向分化潜能，是目前组织工程种子细胞的研究热点。而如何采用干细胞体外诱导分化，产生大量血管内皮细胞一直是该研究领域的焦点和难点［2］。目前国内外均能在体外诱导BMSCs分化为VEC，但其在培养瓶中培养，细胞只能在平面生长，不利于立体组织的形成；且在诱导后移植过程中又有诸多不便。因此寻找一种既能使细胞在其上生长形成立体血管组织、又便于后续组织工程化血管移植的载体就非常重要。海藻酸钠凝胶具有无毒性、生物相容性良好和凝胶过程温和等特点，而且在本课题组的前期研究中证实了海藻酸钠凝胶对BMSCs生长及向成骨细胞分化均有促进作用［3－4］，由此作者首先进行在平面海藻酸钠凝胶上诱导BMSCs分化为VEC的初步研究，以探讨诱导BMSCs在海藻酸钠凝胶上向VEC分化的可行性，并为之后BMSCs在三维立体海藻酸钠凝胶上分化为VEC，并进一步形成血管组织打下良好的实验基础。

1 材料与方法

1.1实验材料 清洁级 Wistar大鼠购于重庆医科大学动物中心，雄性，1个月龄，体质量80g左右。海藻酸钠购于挪威Novamatrix公司，α－MEM培养基和胎牛血清购于美国 Hyclone公司，RNA试剂盒、随机引物 （Olig dT）及逆转录酶（M－MLV）购于鼎国生物技术责任有限公司，重组大鼠血管内皮细胞生长因子 （VEGF）购于美国R＆D公司，抗第Ⅷ因子相关抗原 （vWF）抗体购于英国Abcam公司，罗丹明标记山羊抗兔二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司，CaCl2、甲苯胺蓝为重庆无机化学试剂厂产品，内皮素－1（ET－1）引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。原代细胞提取冲洗液为α－MEM、10%胎牛血清、10%青霉素/链霉素等，完全培养液为α－MEM、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素等。内皮细胞诱导培养液为α－MEM、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、10ng/mL VEGF等。

1.2方法

1.2.1BMSCs分离、纯化和扩增［3］将1个月龄 Wistar大鼠断颈处死，浸泡于75%乙醇中5min，无菌取出大鼠四肢骨，尽量除去四肢骨上附着的肌肉和筋膜等杂质，用含普通培养液中所含抗菌药10倍量的原代细胞提取冲洗液将骨髓冲入离心管，1 000r/min离心5min，用完全培养液重悬后，以5×106个的细胞数接种入250mL塑料培养瓶中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。24h后首次更换培养液，以后每2～3天换液1次。6～7d细胞长满瓶底90%，用含10mmol/L EDTA的0.1%胰蛋白酶消化，重悬浮细胞，并以5×105个的细胞数接种于培养瓶中传代，2～3d更换培养液。传至第2代备用。

1.2.2平面海藻酸钠凝胶的制备［3］用0.1%PBS配制6%海藻酸钠水溶液，搅拌均匀，高温、高压（120℃、0.15MKp）灭菌，4℃备用；种入细胞前用α－MEM稀释，终浓度为3%。吸取3%海藻酸钠水溶液700μL滴入12孔塑料培养板孔内，在孔内形成约1mm厚度的圆盘，再滴入0.1%CaCl22mL于圆盘上，静置40min。待凝胶形成后弃去CaCl2，改用2mLα－MEM浸泡，放入4℃冰箱，每24小时换液1次，72h后用于细胞培养。

1.2.3诱导分化 将2或3代BMSCs以1×105个/孔接种于已制备的平面海藻酸钠凝胶上，采用内皮细胞诱导培养液培养。

1.2.4免疫荧光化学染色 细胞爬片vWF免疫荧光化学染色，未诱导BMSCs作为阴性对照。细胞在诱导到第12天后做细胞爬片，用4%多聚甲醛固定；3%H2O2去离子水孵育5～10min以清除内源性过氧化物酶活性；用蒸馏水冲洗，0.1M PBS浸泡5min；滴加10μL正常山羊血清封闭液，室温下孵育15min倾去；滴加10μL适当稀释的一抗（抗vWF抗体），37℃孵育2～3h，PBS冲洗3次，每次3min；加入罗丹明标记山羊抗兔二抗，37℃避光孵育2～3h，PBS冲洗同前；用甘油封片；荧光显微镜下观察并摄像。

1.2.5免疫组化染色 以 Wistar大鼠舌组织石蜡包埋切片的血管vWF免疫组化染色为阳性对照，未诱导BMSCs作为阴性对照。细胞在诱导到第12天做细胞爬片后，用4%多聚甲醛固定。标本与Wistar大鼠舌组织石蜡包埋血管切片及未诱导的BMSCs细胞爬片同时进行免疫组化染色：用3%H2O2去离子水孵育5～10min以清除内源性过氧化物酶活性；蒸馏水冲洗，0.1MPBS浸泡5min；滴加10μL正常山羊血清封闭液，室温下孵育15min倾去；滴加10μL适当稀释的一抗（抗vWF抗体），37℃孵育2～3h，PBS冲洗3次，每次3min；滴加生物素化二抗工作液，室温下孵育15min；PBS冲洗同前；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温下孵育15min；PBS冲洗后DAB显色剂显色；用自来水充分冲洗后脱水，透明，封片。

1.2.6RT－PCR检测 ET－1表达 提取培养12d细胞的总RNA进行RT－PCR检测，ET－1基因引物序列为：5′－AGG AGT GTG TCT ACT CTG CCA CC－3′，5′－CGA AAG GAG GTC TTG ATG CTG TTG C－3′，扩增产物为383bp。

2 结 果

2.1免疫荧光化学染色和免疫组化染色检测结果 vWF在荧光显微镜观察下，细胞胞浆发出红色荧光（插页Ⅰ图1），且为强阳性。用鼠舌组织作为vWF免疫组化染色的阳性对照，其血管内皮胞浆染为棕黄色；爬片上诱导后的细胞可见部分细胞胞浆染色阳性（插页Ⅰ图2）。未诱导的BMSCs两种检测结果均为阴性。

图1 vWF免疫组化染色结果（×200）

图2 vWF免疫荧光化学染色结果（×200）

2.2ET－1的表达 BMSCs被诱导培养12d后ET－1表达阳性（图3）。

图3 BMSCs分化为VEC的相关基因表达结果

3 讨 论

到目前为止，能够用于临床的组织工程产品数量非常有限，仅局限于几种皮肤和软骨的组织工程产品。其中主要原因之一就是组织工程的血管化问题难以解决。一般认为细胞在血管周围150～200μm内才能通过弥散来维持存活［5］。如果不能建立内在的血液循环，组织工程化组织细胞将在短期内大量死亡，进而导致构建组织工程化组织失败［6］。要构建有一定体积的三维组织工程化组织，就必须考虑早期血管化这一关键问题。

目前构建组织工程化血管的途径有［6］：（1）构建毛细血管网。应用单层VEC植入合成材料内壁，构建出明显的毛细血管网。但这种VEC属于已成熟细胞，其分裂增殖能力低下且还存在去分化的倾向，致使管壁中段内皮细胞有时不完全，平滑肌生长也不完整。（2）体内埋植构建轴向血管。将组织工程化组织植入机体的皮下、肌内或骨膜下等区域，该区域必须包含有一定管径的血管，达到可以用显微外科方法吻合。但此法容易损伤预构区组织，带来各种并发症，此外二次转瓣和吻合时对组织工程化组织新生血管是有创伤的，不利于组织再生。以上途径均面临技术上急需解决的关键问题，血管化成功率较低，因此找寻更为优良的种子细胞并于体外构建完善的血供体系是当前研究的热点。

BMSCs作为种子细胞的作用备受重视，其具有其他细胞所不可比拟的优越性：（1）从自身骨髓培养扩增的BMSCs诱导为VEC不存在组织相容性问题；即使是同种异体，BMSCs也属于未分化的前体干细胞，具有免疫独特性，其细胞表型的分化尚不成熟，移植的排斥反应较弱。（2）BMSCs具有旺盛的增殖分化潜能，多次传代后仍然保持相同形态和无接触抑制的特点［7］，并且在无诱导剂情况下，可保持25代内无分化趋势。郭新和李玉林［8］认为利用BMSCs进行血管内皮构建，可促进工程化器官的血管再生、机体缺血性疾病的治疗，同时也解决了再生小口径血管（＜5mm）易发生血栓的问题，具有广阔的应用前景。加之骨髓作为BMSCs的来源具有易获取、BMSCs易分离、体外培养条件要求不高等特点，因此被认为是血管组织工程种子细胞的理想来源［9］。有学者提取BMSCs经VEGF、表皮生长因子和皮质醇激素诱导3周，同样诱导出具有内皮特性的细胞，并发现有一些细胞因子分泌［10］。Liang和Wang［11］应用VEGF和碱性成纤维生长因子诱导BMSCs后发现，细胞形成血管腔样结构，周围有成铺路石样排列的内皮样细胞。以上研究结果均提示BMSCs可向VEC分化。

但是在之前的研究中采用的平面培养系统，不利于立体血管组织的形成；且在诱导后移植过程中又有诸多的不便。因此需要寻找一种既能使细胞在其上生长形成立体组织，且便于后续组织工程化血管移植的载体。海藻酸钠凝胶具有良好的生物相容性，即无毒性、不致敏、不致癌和不致畸，植入后也无免疫原性，同时具有良好的可塑性，能被方便加工成所需的形状，以形成符合设计外形的新组织，因此得到了越来越多专家和学者的重视和应用［12］。Sasa等［13］采用海藻酸钠凝胶作为微球载体，在其上对人BMSCs培养及定向分化进一步证实了海藻酸钠凝胶载体对BMSCs生长、增殖及诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞过程中的促进作用。本课题组前期研究表明，BMSCs在海藻酸钠凝胶上能很快适应微环境改变，迅速黏附、贴壁进入增殖期，并且能促进BMSCs诱导分化为成骨细胞［3－4］。因此作者进一步尝试在海藻酸钠凝胶上诱导BMSCs分化为VEC，初步探讨在海藻酸钠凝胶上形成立体血管网的可行性。

目前鉴定VEC的特征性标志，包括vWF、CD31、KDR（又称 VEGFR－2）、fit－1、Tie－1、Tie－2和 VE－钙黏素、ET－1等，早期还表达CD34抗原［14］。本研究选择了2种因子（vWF和ET－1）分别进行检测，对vWF的表达进行免疫组化染色和免疫荧光化学染色，发现在海藻酸钠凝胶上诱导12d的细胞经免疫组化染色为棕黄色，免疫荧光化学染色呈红色，证明诱导的细胞中分泌vWF。ET－1属于内皮素家族，是由21个氨基酸组成的多肽，是已知的最有力的内源性血管收缩因子，它主要由血管内皮产生并介导包括血管收缩、白细胞激活和细胞增生（血管重构）等一系列反应，血管VEC通过释放ET收缩血管和促进VEC增殖［15］。本研究结果显示，ET－1表达为阳性，也进一步提示BMSCs已经分化为VEC。这一结果也显示了海藻酸钠凝胶不影响BMSCs向VEC分化。

本研究结果初步证实了在平面海藻酸钠凝胶上BMSCs能够定向诱导分化为VEC，为进一步研究BMSCs在三维立体海藻酸钠凝胶上向VEC分化进而形成便于移植的血管组织打下坚实的实验基础。

综上所述，以VEGF为诱导剂可以将BMSCs在海藻酸钠凝胶上成功地诱导为VEC，为组织工程血管化提供获取方便、可以大量扩增种子细胞，同时也为海藻酸钠凝胶成为组织工程化血管形成过程中可选择的、较好的支架提供了实验依据。

［1］张志，姚敏，许伟石.组织工程血管化的研究进展［J］.中华烧伤杂志，2004，20（5）：318.

［2］丁洋，万圣云.体外诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的研究［J］.医学综述，2008，14（7）：987.

［3］王嫣，陈小菊，周兰，等.海藻酸钠凝胶对骨髓间充质干细胞生物学效应的初步研究［J］.重庆医科大学学报，2006，31（4）：478.

［4］王嫣，陈小菊，周兰，等.在海藻酸钠凝胶上诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞［J］.中国生物工程杂志，2006，26（9）：38.

［5］Colton C.Implantable biohybrid artificial organs［J］.Cell Transplant，1995，4：415.

［6］董青山，毛天球.骨组织工程血管化技术的构建思路［J］.国际口腔医学杂志，2008，35（3）：321.

［7］董鸿铭，柏树令.小鼠骨髓基质干细胞的培养及常见的组化染色方法［J］.中国医科大学学报，2004，33（4）：294.

［8］郭新，李玉林.间充质干细胞分化为VEC的意义和细胞学基础［J］.生理科学进展，2005，36（3）：204.

［9］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et a1.Multi－lineage potential of adult human mesenchymal stem cell［J］.Science，1999，284：143.

［10］Gang EJ，Jeong JA，Han S，et al.In vitro endothelial potential of human UC blood－derived mesenchymal stem cells［J］.Cytothernpy，2006，8（3）：215.

［11］Liang F，Wang YF.In vitro differentiation of human bone marrow－derived mesenchymal stem cells into blood vessel endothelial cells［J］.Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2005，27（6）：665.

［12］Humacher DW.Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage［J］.Biomaterials，2000，21（24）：2529.

［13］Sasa Trkov，George Eng，Rosa DL，et al.Micropatterned three－dimensional hydrogel system to study human endothelial－mesenchymal stem cell interactions［J］.Tissue Eng Regen Med，2009，10（2）：231.

［14］Dumont DJ，Yamaguchi TP，Conlon RA，et al.Tek，a novel tyrosine gene located on mouse chromosome 4，is expressed in endothelial cells and their precursors［J］.Oncogene，1992，7（8）：1471.

［15］冯勇，胡海地，段志泉，等.大鼠自体移植静脉血管平滑肌细胞增殖与血浆内皮素变化关系的动态研究［J］.中国医科大学学报，2002，31（5）：341.