奥曲肽抑制人卵巢癌细胞增殖的研究

李炜虹，沈杨，张云霞，任慕兰

(1.南京市市级机关医院 妇科，江苏 南京 210008;2.东南大学附属中大医院妇产科，江苏 南京 210009)

生长抑素(somatostatin，SST)是一种环状多肽类激素，由Brazeau等［1］于1973年从羊下丘脑中分离提取。现在认为SST对许多疾病如肿瘤、炎症、糖尿病、癫痫、早老性痴呆、帕金森病、亨廷顿舞蹈病以及艾滋病的发生、发展和防治具有重要意义［2］。奥曲肽(SMS-201995，OCT)为SST 8肽类似物，是第一个用于临床的SST类似物，目前其主要用于肝癌、胃癌和胰腺癌的辅助治疗。

1 材料和方法

1.1 材料

基础培养液:RPMI 1640培养液，加入10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶(上海华美公司):溶于D-Hanks液中配制成0.25%浓度;SST类似物OCT:由上海子能制药有限公司合成;顺铂(cisplatin):山东齐鲁制药厂产品，4℃保存;人卵巢癌细胞株SKOV3:购自第四军医大学西京医院妇产科实验室，细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化细胞成单细胞悬液;雌性BALB/c-nu/nu裸小鼠:购自中国医学科学院实验动物研究所，体重18～22 g，SPF环境下饲养;兔抗人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体:购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立 将SKOV3细胞制成单细胞悬液，以5×106个细胞·只－1接种于裸鼠右侧腋窝靠近背部皮下，共接种20只。

1.2.2 药物干预移植瘤 建模2周后将20只裸鼠随机分成空白对照组、OCT组、顺铂组、OCT与顺铂联用组4组，每组5只。空白对照组皮下注射生理盐水100 μg·kg－1，1 次·d－1;OCT 组皮下注射 OCT 100 μg·kg－1，1 次·d－1;顺铂组分别于成瘤后第 1、8、15、22 日腹腔注射顺铂4 mg·kg－1;OCT与顺铂联用组皮下注射 OCT 100 μg·kg－1，1 次·d－1，并于成瘤后第1、8、15、22日腹腔注射顺铂4 mg·kg－1。用药4周后颈椎脱位法处死裸鼠，皮下剥离瘤体，称取肿瘤重量，游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，按公式V=ab2/2计算肿瘤体积。抑瘤率=(对照组瘤体积－实验组瘤体积)/对照组瘤体积×100%。肿瘤标本分为两份，1份置于10%中性缓冲福尔马林液中固定，常规脱水，透明，浸蜡，包埋，5 μm连续切片;另1份立即制成单细胞悬液行流式细胞分析。

1.2.3 病理学分析及免疫组织化学法检测VEGF表达 肿瘤切片行常规苏木精-伊红染色，显微镜下观察肿瘤细胞形态。免疫组织化学染色采用两步法，结果判定以细胞浆呈清晰棕黄色为阳性，采用计算机图像分析软件Image-Pro plus 4.5对VEGF阳性部位进行原位定量检测，每张切片随机选取5个视野，自动选取阳性部位并计算平均光密度(IOD)值，计算5个视野的平均值作为该切片的代表值。

1.3 统计学处理

结果以均数±标准差表示，数据处理采用SPSS 11.5统计软件，多组间比较采用方差分析，两两之间用q检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 OCT对裸鼠卵巢癌移植瘤生长的影响

20只裸鼠接种7 d后于接种部位皮下均可见直径约2 mm的瘤块，致瘤率为100%，用药满28 d时20只裸鼠均存活。处死裸鼠见肿瘤处皮肤表面无溃疡结痂，肿瘤包膜完整，均可用手推动。OCT组、顺铂组、OCT与顺铂联用组肿瘤重量及体积均明显低于空白对照组，差异有统计学意义。各用药组两两比较，肿瘤重量及体积无显著性差异。见表1。

表1 各用药组移植瘤重量及体积的变化Tab 1 Changes of tumor weight and volume in treated mice

2.2 病理学分析及免疫组织化学法检测VEGF表达

肿瘤组织苏木精-伊红染色切片见肿瘤细胞大小不一，胞浆粉红色，核圆形，肿瘤内可见血管结构。VEGF染色主要定位于肿瘤细胞胞浆，呈棕黄色，少数血管内皮细胞也见有阳性表达。各用药组移植瘤组织中VEGF表达明显下降，与空白对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.001)，但各用药组两两间比较差异无统计学意义(P=0.267)。见图1。

图1 免疫组织化学法检测各实验组肿瘤组织VEGF的表达Fig 1 VEGF expressions on tumor was examined by immunohistochemistry

3 讨 论

SST广泛分布于大多数人体器官组织，具有抑制激素分泌、调节神经传递及细胞增殖的作用。已有研究证实卵巢癌中存在生长抑素受体(SSTR)的表达，如陈怀增等［3］采用RT-PCR方法证实卵巢癌细胞株SKOV3及3AO均表达Ⅱ型 SSTR(SSTR2)。Hall等［4］利用免疫组织化学方法对63例恶性卵巢肿瘤和35例良性卵巢肿瘤患者的SSTR表达进行了检测，发现SSTR在肿瘤组织上皮、间质以及血管中均有不同程度的表达，在卵巢肿瘤组织血管壁的中膜平滑肌中亦可见SSTR的高表达。这些实验提供了SST治疗卵巢癌的可能性。

本实验结果显示在给予OCT、顺铂及两药联合应用后，移植瘤重量及体积均明显低于空白对照组，但各用药组两两间比较抑瘤作用无显著性差异，提示对于卵巢癌，非化疗药OCT可能具有相当于顺铂的抗肿瘤效果。顺铂是目前临床治疗卵巢癌患者的一线化疗药物，但其毒副反应较大且易产生耐药，而肽类化合物OCT副反应小，可望用于对顺铂耐药的卵巢癌患者。

肿瘤的血管生成是由肿瘤细胞分泌的各种促血管生成因子所诱发，其中VEGF是迄今为止发现的最重要的血管生成因子。它具有增加血管通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建及促使内皮细胞迁移等多种作用，以VEGF作为抗肿瘤血管生成治疗的理想靶点已逐渐成为国内外学者的共识。Osada等［5］的研究表明，VEGF高表达的卵巢癌患者生存率明显低于VEGF低表达者。本实验采用免疫组织化学染色法检测肿瘤组织内VEGF的表达，结果显示各用药组VEGF的表达较空白对照组明显下降，提示OCT抗肿瘤作用机制之一为抑制肿瘤新生血管生成。

据文献［6-10］报道SST及SSTA抗肿瘤作用的机制可能包括:(1)通过与SSTR结合直接抑制肿瘤细胞增殖;(2)抑制促肿瘤生长的激素或细胞因子的释放;(3)抑制肿瘤血管生成;(4)诱导肿瘤细胞凋亡。

本实验证实OCT对卵巢癌细胞株的抑制作用与传统抗肿瘤药顺铂相当，可为卵巢癌治疗提供新途径。

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