环氧和酶-2、基质金属酶-2、9 在子宫内膜息肉中表达和相关性研究

曾 嫣，杨祖菁

（上海交通大学医学院附属新华医院科研部，上海 200092）

子宫内膜息肉属子宫内膜良性病变，是导致子宫异常出血的常见病因。此病多见于35岁以上妇女，随年龄增加其发病率逐步上升。据国外报道发生率24%～25%[1]，国内为5.7%[2]。近年来妇科检查及应用激素补充治疗人数的增多，子宫内膜息肉的检出率、发病率明显上升，且其存在癌变的可能性，文献报道年轻妇女的癌变率为0.5%～4.8%，更年期和绝经后妇女的癌变率达10%～15%。因而引发更多的关注。

环氧和酶-2（COX-2）、基质金属酶-2、9（MMP-2、9）在子宫内膜中的表达受到局部雌激素水平的影响[3]。本课题通过检测绝经前后子宫内膜息肉组织中环氧和酶-2、基质金属酶-2、9的表达，并与绝经后正常子宫内膜组织中COX-2及 MMP-2、9表达相比较，进行相关性研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集本院自2006年1月至2009年6月间经宫腔镜探查并取活组织检查，经病理诊断为子宫内膜息肉的完整病史资料按绝经与否分两组，各取30例。绝经前患者月经周期规则；绝经后患者闭经大于12月、FSH超过40Miu/L，E2低于50 pg/mL。所有患者均未使用非甾体类解热镇痛药、性激素类药物。同时选取正常子宫内膜共30例为对照组，此类内膜取自正常绝经后妇女因子宫脱垂或卵巢囊肿行全子宫切除标本，经病理诊断明确。

1.2 实验试剂

本研究采用的免疫组织化学试剂为COX-2及 MMP-2、9鼠抗单克隆抗体，购自上海长岛生物技术有限公司。抗体工作浓度为1：25。

1.3 实验方法

GnRHR免疫组化染色步骤：取存档石蜡制成4 um连续切片，60°C烤片。切片脱腊至水化。TBS洗涤2 min×3次。微波抗原修复（PH8.0 EDTA，PH7.4 Tris-cl配制的缓冲液）800W5 min×3次，取出后室温下冷却。TBS洗涤2 min×3次。加入GnRHR 抗体，室温过夜。次日再行TBS洗涤2 min×3次。滴加SupervisionTM-HRP，置入湿盒中，室温下1 h。滴加DAB显色液，显色50 min左右，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗。苏木素复染30 s，自来水冲洗。脱水。透明：二甲苯I 15 min、二甲苯II 15 min。树胶封片，盖上玻璃片。

1.4 结果判断标准

观察阳性反应采用双盲法。GnRHR表达定位于与细胞质，当上述部位出现明显棕黄色颗粒为阳性。按标本中阳性细胞百分比及染色强度进行综合评分，阳性细胞为5个高倍镜（10×40）随机视野的阳性细胞百分比；着色强度以多数细胞的染色情况记分，按表1的方法给予半定量评分。每例组织细胞最后得分为A×B：0分为阴性，1～4分为弱阳性（＋），5～8分为阳性（＋＋），9～12分为强阳性（＋＋＋）。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。采用卡方检验和非参数统计中的秩和检验对多组数据进行分析。分析结果以P＜0.05作为有统计学意义的标准，以P＜0.01 为有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 COX-2、MMP-2、MMP-9在绝经前、后子宫内膜息肉的表达差异

COX-2在子宫内膜息肉的上皮组织的表达：绝经前组中弱阳性80%（n＝24例）阳性10%（n＝3例），强阳性10%（n＝3例）。绝经后组中弱阳性50%（n＝15例），阳性50%（n＝15例）。前组以低水平表达为主，占80%，后组中低水平与高水平表达各占50%。两组间表达差异具有统计学意义（χ2=13.08，P＜0.01）。（见表1）。

表1 绝经前、后内膜息肉上皮组织内COX-2蛋白的表达情况

COX-2在间质组织中的表达：绝经前组弱阳性30%（n＝9例），阳性70%（n＝21例），其高水平表达占70%；绝经后组中弱阳性60%（n＝24例），阳性20%（n＝6例），其低表达占60%。两组表达差异具有统计学意义（χ2=15.15，P＜0.05）。（见表2）。

表2 绝经前、后内膜息肉间质组织内COX-2蛋白的表达情况

2.2 MMP-2在子宫内膜息肉的上皮组织的表达

绝经前组中弱阳性40%（n＝12例），阳性50%（n＝15例），强阳性10%（n＝3例），其高水平表达占60%；绝经后组中弱阳性20%（n＝6例），阳性50%（n＝15例），强阳性30%（n＝9例），其高水平表达占80%，两组间差异不具有统计学意义（χ2=5.0，P＞0.05）。（见表3）。

表3 绝经前、后内膜息肉上皮组织内MMP-2蛋白的表达情况

MMP-2在间质组织中的表达：绝经前组弱阳性80%（n＝24例），阳性10%（n＝3例），强阳性10%（n＝3例），以低水平表达为主占80%。绝经后组中弱阳性30%（n＝9例），阳性40%（n＝12例），强阳性30%（n＝9例），其高水平表达为70%，故两组表达差异具有统计学意义（χ2=15.22，P＜0.01）。（见表4）。

表4 绝经前、后内膜息肉间质组织内MMP-2蛋白的表达情况

2.3 MMP-9在子宫内膜息肉的上皮组织的表达

绝经前组中弱阳性40%（n＝12例），阳性50%（n＝15例），强阳性30%（n＝3例），高水平表达占80%。绝经后组中弱阳性20%（n＝6例），阳性70%（n＝21例），强阳性10%（n＝3例），高水平表达同样为80%，两组表达差异无统计学意义（χ2=1.98，P ＞0.05）。（见表5）。

表5 绝经前、后内膜息肉上皮组织内MMP-9蛋白的表达情况

MMP-9在间质组织中绝经前组弱阳性70%（n＝21例），阳性20%（n＝6例），强阳性10%（n＝3例），以低水平表达为主。绝经后组中弱阳性30%（n＝9例），阳性60%（n＝18例），强阳性10%（n＝3例），其高水平表达占70%，故两组表达差异具有统计学意义（χ2=10.8，P＜0.01）。（见表6）。

表6 绝经前、后内膜息肉间质组织内MMP-9蛋白的表达情况

2.4 COX-2、MMP-2、MMP-9在绝经后正常子宫内膜和绝经后内膜息肉组织中表达差异

2.4.1 在上皮组织中COX-2在绝经后正常子宫内膜中表达阴性70%（n＝21例），弱阳性30%（n＝9例）。在绝经后子宫内膜息肉中表达弱阳性50%（n＝15例），阳性50%（n＝15例），因此COX-2在绝经后内膜息肉中的表达率明显高于绝经后正常子宫内膜。以Kruskal-Wallis检验：H＝21.85，P＜0.01，两组间表达差异具有统计学意义。（见表7）。

在间质组织中COX-2在绝经后正常子宫内膜中100%（n＝30例）均表达为阴性。在绝经后子宫内膜息肉中表达弱阳性80%（n＝24例），阳性20%（n＝6例），两组表达的差异以Kruskal-Wallis检验示H＝51.44，P＜0.01，故具有统计学意义。（见表8）。

表7 COX-2在绝经后内膜息肉和正常内膜上皮组织中的表达情况

表8 COX-2在绝经后内膜息肉和正常内膜间质组织中的表达情况

2.4.2 在上皮组织中MMP-2在绝经后正常子宫内膜中表达阴性40%（n＝12例），弱阳性30%（n＝9例），阳性30%（n＝9例），阳性的高水平表达率占30%。在绝经后子宫内膜息肉中表达弱阳性10%（n＝3例），阳性80%（n＝24例），强阳性10%（n＝3例），高水平表达率占90%。以Kruskal-Wallis检验：H＝18.38，P＜0.01，两组间表达差异具有统计学意义。（见表9）。

表9 MMP-2在绝经后内膜息肉和正常内膜上皮组织中的表达情况

在间质组织中MMP-2在绝经后正常子宫内膜中阴性60%（n＝18例），弱阳性40%（n＝12例），其阳性呈低水平表达。在绝经后子宫内膜息肉中表达弱阳性30%（n＝9例），阳性40%（n＝12例），强阳性30%（n＝9例），其阳性的高水平表达占70%。以Kruskal-Wallis检验：H＝38.62，P＜0.01，两组间表达差异具有统计学意义。（见表10）。

表10 MMP-2在绝经后内膜息肉和正常内膜间质组织中的表达情况

2.4.3 在上皮组织中MMP-9在绝经后正常子宫内膜中表达阴性60%（n＝18例），弱阳性40%（n＝12例），其低水平的阳性表达率为40%。在绝经后子宫内膜息肉中表达弱阳性20%（n＝6例），阳性70%（n＝21例），强阳性10%（n＝3例），其高水平的阳性表达率为主，占80%。以Kruskal-Wallis检验：H＝42.46，P＜0.01，两组间表达差异具有统计学意义。（见表11）。

表11 MMP-9在绝经后内膜息肉和正常内膜上皮组织中的表达情况

在间质组织中MMP-9在绝经后正常子宫内膜中表达阴性60%（n＝18例），弱阳性20%（n＝6例），阳性20%（n＝6例）。在绝经后子宫内膜息肉中表达弱阳性30%（n＝9例），阳性60%（n＝18例），强阳性10%（n＝3例），两组比较后组的阳性表达率及表达强度均高于前组。以Kruskal-Wallis检验：H＝23.62，P＜0.01，两组间表达差异具有统计学意义（见表12）。

表12 MMP-9在绝经后内膜息肉和正常内膜间质组织中的表达情况

3 讨论

随着妇科超声及宫腔镜的广泛应用，子宫内膜息肉的诊断率逐渐升高。因其存在一定的复发率、恶变率而日益受到关注。子宫内膜息肉的病理表现为子宫内膜腺体和间质围绕一血管核心的局限性过度增生。这种过度增生的原因未明。长期以来认为可能的相关原因是持续的雌激素刺激，包括内源性激素、外源性因素：激素补充治疗、乳腺癌术后他莫昔芬治疗；局部内膜对雌、孕激素反应异常或孕激素缺乏；长期机械因素刺激或生物致炎因子作用引起的反应性增生等。

由于子宫内膜息肉的病因、病理尚不明确，因此有研究转而在分子结构水平进行探讨，特别是其表达受雌激素水平影响的蛋白酶类引起关注，如环氧合酶（COX）、基质金属蛋白酶（MMPs）在子宫内膜中表达均受雌激素水平影响，通过对该类蛋白酶类的检测以期发现其对子宫内膜息肉可能具有的作用。

环氧和酶（cyclooxygenase，COX）是一种膜结合蛋白，作为一双功能酶，即具有环氧合酶及过氧化物酶的活性。目前已知COX至少有两种异构体，即COX-1和COX-2。COX-2呈诱生性表达，在细胞损伤、炎症或恶性转化时表达上调。COX-2可有多种因素诱导表达，包括细胞因子、生长因子癌基因、促癌剂等。COX-2的主要致病机理：促进细胞增殖，抑制细胞凋亡；促进肿瘤新生血管的形成。对肿瘤的发生、发展起重要作用。同样作用于良性肿瘤。COX-2在正常子宫内膜中呈低度表达。其活性随着月经周期发生变化，在黄体期，其表达活性显著下降[1-3]。

以往的研究显示雌激素能影响COX-2的表[4]。因此，有人对COX-2与子宫内膜息肉的关系进行了研究。Maia JR 等通过对52例绝经后内膜息肉组织中COX-2的免疫组化检测，发现在绝经后内膜息肉的腺上皮中COX-2呈阳性表达。[5]Erdemoglu E等在排除了使用外源性激素或解热镇痛药等因素后进一步对绝经前、后子宫内膜息肉中COX-2进行检测，发现COX-2在绝经前、后内膜息肉均有表达，在上皮组织中两组的表达差异无统计学意义，但在间质组织中表达绝经前病例显著高于绝经后病例，差异具有统计学意义。

在本研究中，绝经前、后子宫内膜息肉的COX-2在上皮及间质组织呈100%表达。但不同组织中其表达程度不同：在上皮组织中绝经前组：弱阳性占80%，阳性及强阳性占20%。绝经后组：弱阳性占50%，阳性占50%。相比较而言，绝经后组的高水平表达比绝经前组显著。在间质组织中绝经前组：弱阳性占30%，阳性占70%。绝经后组：弱阳性占80%，阳性占20%。因而在间质中绝经前组的高水平表达高于绝经后组，且具有统计学意义。该结果与Erdemoglu E等检测结果相一致。

为了进一步探讨子宫内膜息肉中COX-2表达的意义，本研究对绝经后子宫内膜息肉和绝经后正常子宫内膜中COX-2表达进行比较。实验发现在上皮组织中COX-2在绝经后子宫内膜息肉中表达弱阳性及阳性各占50%，在绝经后正常子宫内膜中表达阴性70%，弱阳性30%。因此绝经后内膜息肉中的表达率明显高于绝经后正常子宫内膜，两组间差异具有统计学意义。在间质组织中COX-2在绝经后子宫内膜息肉中呈弱阳性80%，阳性20%，绝经后正常子宫内膜中均为阴性。故内膜息肉的表达明显高于正常内膜，两组差异具有统计学意义。

综合上述两个结果推断COX-2在子宫内膜息肉形成中可能有一定作用，特别是对绝经后内膜息肉的形成。相对于绝经后正常子宫内膜，绝经后内膜息肉的上皮及间质组织中COX-2显著表达，此种差异可能引起绝经后低激素环境下子宫内膜的局限性增生、新生血管的生成，对息肉形成具有促进作用。有文献提出COX-2在子宫内膜息肉的与出现可能提示该蛋白酶对子宫内膜息肉的生成与其在结肠息肉中发挥同样作用。目前流行病学调查发现应用非甾体类抗炎药（ Nonsteroidal anti-inf l ammatory drugs，NSAIDs）可以降低大肠肿瘤的危险度，因而NSAIDs成为近年肿瘤防治的热点之一。实验证明选择性COX-2抑制剂Celecoxib可抑制直肠腺瘤的增生，诱导细胞的凋亡，减少息肉的数目、体积，为其治疗开辟了新途径，较非选择性的COX-2抑制剂在增加安全性的同时避免了副作用，具有预防和治疗作用。因此本研究检测的COX-2与子宫内膜息肉之间的关系不仅为探讨病因、病理，而且为选择性COX-2抑制剂运用于息肉的预防和治疗提供依据。

基质金属蛋白酶类在许多生理过程中发挥重要作用，特别是明胶酶（IV型还原酶），包括明胶酶A（MMP-2），明胶酶B（MMP-9）参与了细胞外基质的降解，基底膜屏障的解离，促进新生血管形成，在肿瘤的转移发挥重要作用。MMPs的表达同样受到雌激素水平的影响。明胶酶A（MMP-2），明胶酶B（MMP-9）作用于IV型胶原蛋白和纤维结合素，从而降解血管及上皮下基底膜组织。文献报道一些MMPs在正常内膜的生理改变中发挥作用，参与月经期细胞外基质的降解、组织的剥脱。MMP-9在月经期正常剥脱的子宫内膜及间质中出现，而MMP-2在整个月经周期中均有表达，至经期显著上升[6-7]。关于子宫内膜息肉的MMPs表达只在少量文献中报道。Erdemoglu E等也对绝经前、后子宫内膜息肉中MMP-2、MMP-9进行了检测，发现MMP-2、MMP-9表达在间质组织中绝经前均显著高于绝经后；而上皮组织中MMP-9表达同样是绝经前显著高于绝经后，MMP-2表达差异在两组中无统计学意义。

本研究发现：MMP-2在子宫内膜息肉的上皮组织的表达：两组上皮组织中蛋白酶均呈显著表达，组间差异不具有统计学意义。但是在间质组织中绝经后组的表达显著高于绝经前组，差异具有统计学意义。此结果与文献报道的相一致。

同样MMP-9在子宫内膜息肉的上皮组织的表达：MMP-9在子宫内膜息肉的上皮组织的表达：绝经前组高水平表达占80%。绝经后组中高水平表达同样为80%，两组差异无统计学意义。在间质组织中绝经前组以低水平表达为主。绝经后组中其高水平表达占70%，故间质组织中同样为绝经后组的表达更为显著，组间差异具有统计学意义。此结果也与文献报道的相一致。

同样本研究对绝经后子宫内膜息肉与绝经后正常子宫内膜的MMP-2、MMP-9表达进行进一步比较。

在上皮组织中MMP-2在绝经后正常子宫内膜中阳性的高水平表达率占30%。在绝经后子宫内膜息肉中高水平表达率占90%。绝经后组的表达明显强于绝经后正常内膜。两组间表达差异具有统计学意义。在间质组织中MMP-2在绝经后正常子宫内膜其阳性呈低水平表达。在绝经后子宫内膜息肉中其阳性的高水平表达占70%。绝经后组的表达也明显强于绝经后正常内膜。

在上皮组织中MMP-9在绝经后正常子宫内膜中其低水平的阳性表达率为40%。在绝经后子宫内膜息肉中其高水平的阳性表达率为主，占80%。两组间表达差异有统计学意义。在间质组织中MMP-9在绝经后正常子宫内膜中表达阴性60%，弱阳性20%，阳性20%。在绝经后子宫内膜息肉中表达弱阳性30%，阳性60%，强阳性10%，两组比较绝经后组的阳性表达率及表达强度均高于前组。

因此本组结果表明MMP-2、MMP-9在绝经前后内膜息肉上皮中均有显著表达。而在间质中绝经后组的表达较前组差异具统计学意义。该结果可能提示两者在内膜息肉形成中具有作用，具体机理尚待深入研究。另外，能否与恶性肿瘤一样通过检测MMP-2、MMP-9用于判断其复发和预后须进行长期随访。目前MMPs的抑制剂已产生，包括广谱和选择性，在减少肿瘤的局部生成和抑制远处转移中有一定疗效，如能应用于良性病变，可作为内膜息肉的新的治疗方法。

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