孕妇血浆中游离胎儿DNA短串联重复序列检测*

陈晓蕾，李新伟，李 杨，陈 辉，雷冬梅，李晓文#

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室郑州450001 2)第二军医大学病原生物学教研室上海200433 3)漯河高等医学专科学校生物学教研室漯河462000 4)郑州大学第三附属医院病理科郑州450052

在分子生物学产前诊断中，羊水穿刺术等传统的采样方法有可能对孕妇和胎儿造成伤害，而利用孕早中期母体外周血浆中的游离胎儿DNA进行产前诊断，取材简便安全，容易被孕妇及家属接受［1-2］，且母血中游离胎儿DNA半衰期很短，前次妊娠不会影响到下次妊娠的诊断结果。孕早中期母体血浆中胎儿DNA含量极其微小，作者应用短串联重复序列(short tandem repeat，STR)位点检测孕早中期胎儿遗传信息，为建立一种无创性产前诊断的方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源 34例健康孕妇来自郑州大学第三附属医院妇产科门诊，年龄25～42岁，无异常妊娠史。经B超检查所孕均为单胎，孕龄7～32周。在知情同意的前提下取材:34例孕妇外周静脉血作为标本;口腔上皮细胞拭子作为母源对照;孕妇配偶外周血DNA作为父源对照。

1.2 引物合成 参照GenBank的基因序列设计引物，使扩增产物大小在 200～350 bp之间。D17S1293上游引物序列 5’-TGGAGGCTAG GAGTTTTCCT-3’，下游引物序列 5’-GGAGGCAGT GAGTTGTGATT-3’;D21S11上游引物序列5’-TAT GTGAGTCAATTCCCCAAGTGA-3’，下游引物序列5’-GTTGTATTAGTCAATGTTCTCCAG-3’;DXS8377上游引物序列 5’-CACTTCATGGCTTACCAG-3’，下游引物序列 5’-GACCTTTGGAAAGCTAGTGT-3’。引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。使用前分别溶于 TE Buffer，使其终浓度为10 μmol/L，－20℃冰箱保存。

1.3 STR位点检测方法 ①DNA抽提:孕妇外周血二步离心法离心后取上清得到孕妇外周血血浆［3］，使用Tiangen的血液基因组小量抽提试剂盒，按说明书抽提其DNA。使用Chelex-100法抽提孕妇口腔上皮拭子标本DNA。使用酚氯仿法抽提外周血血细胞基因组DNA。②PCR反应体系:Premix Taq®25 μL;引物(上下游引物等体积混合，终浓度10 μmol/L)4 μL，扩增模板分别为血细胞基因组DNA 1 μL、血浆 DNA 5 μL 及口腔上皮拭子 DNA 2 μL，用超纯去离子水补足体系至50 μL。③扩增条件:98℃预变性6 min;94℃ 1 min，63℃ 1 min，70℃ 1 min 30 s，进行2个循环;此后每2个循环退火温度依次降低1℃，共进行14个循环;90℃ 1 min，56℃ 1 min，70℃ 1 min 30 s，进行21个循环;60℃延伸25 min。4℃保存。④二次PCR:孕妇血浆DNA 的初次扩增产物分别稀释 1、5、10、50、100、500及1 000倍;孕妇口腔上皮拭子标本DNA的初次扩增产物稀释100倍，扩增体系和条件同上。扩增产物经80 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。

2 结果

34例孕妇血浆样本在3个STR位点中，每例均有1个以上位点检出非母源的STR等位基因，即胎儿DNA。在17例父源性DNA存在时，可验证该条带为父源性STR等位基因(图1，以D21S11位点为例)。

图1 某家系D21S11位点扩增产物电泳图谱

3 讨论

检测孕妇血浆中游离胎儿DNA虽然取材简便，安全性强，但其应用上也面临着很多问题:例如母体白细胞及白细胞来源DNA的污染;胎儿DNA的不稳定性及其含量的稀少性和多变性;抽提/定量过程困难、耗时;DNA质量太低;PCR抑制因子的存在等。因此，许多技术细节都影响着最后检测结果的敏感性和准确性。

取材时间的选择:孕妇血浆中游离胎儿DNA的含量极少，每mL含量甚至可以低至ng级别，造成严重的抽提困难。但其会随着孕龄的增加而增加，尤其在孕后8周增加迅速，分娩前8周还会出现一次急剧升高。因此，在运用孕妇血浆中的游离胎儿DNA进行产前诊断时，采血时间十分重要。一方面要保证游离胎儿DNA含量达到稳定检测的需求，另一方面要符合中期引产的时间要求，一旦发现异常胎儿，孕妇决定中止妊娠，不至于对孕妇的身体造成过大的伤害。该组孕妇孕龄7周1例，14～20周32例，32周1例。孕32周的孕妇血浆中胎儿DNA含量较高，初次PCR的产物稀释1 000倍后作为第二次PCR的模板也能扩增出符合检测标准的产物;孕14～20周的孕妇血浆中胎儿DNA初次PCR产物稀释50～500倍作为第二次PCR的模板，均能扩增出符合检测标准的产物;而孕7周的孕妇血浆中胎儿DNA初次PCR产物不经稀释，直接作为第二次PCR的模板才能扩增出达到检测标准的产物，表明孕8周以前孕妇血浆中胎儿DNA含量低，与文献［4］报道一致。本着准确和安全的原则，作者认为，利用孕妇血浆中游离胎儿DNA进行产前诊断时，孕10～15周之间取样检测比较合适。

DNA抽提条件:采集孕妇外周血后，必须尽快对血浆和血细胞进行分离。作者在采血6 h内对血样进行处理并抽提DNA［5］。如不能立即进行DNA抽提，采血时不能用肝素或者柠檬酸钠作为抗凝剂，必须使用EDTA，这样才能既保护游离DNA不被核酸酶降解，又不干扰后续的PCR反应［4］。而且应立即置于超低温(－70℃)条件保存，否则，由于游离胎儿DNA的不稳定性和母体血细胞大量裂解释放背景DNA，24 h后将无法有效抽提到胎儿DNA［6］。

实验组中母源性干扰的排除:抽提母血中胎儿DNA的另一大难点在于如何在母体DNA背景非常丰富的情况下尽可能地分离胎儿DNA。选择特定的血浆离心速度非常重要，作者采用二步离心法:先低速离心(800 g)分离血浆与细胞性成分，去除母体血细胞DNA背景;再依据孕妇体内胎源性DNA的长度小于母源性循环DNA的长度，使用超高速离心(16 000 g)将其区分开来，可减弱PCR产物电泳图谱上来自母体DNA的干扰。

提高检测的敏感性:孕妇血浆DNA、口腔上皮拭子DNA含量偏低，普通的一次PCR无法得到适合判读的条带。因此采用二次PCR的方法，以保证检测的敏感性。但普通的二次扩增很容易出现许多非特异条带，影响判读，因此作者将2次扩增都采用降落PCR的方法，杂带出现明显减少，保证了扩增的特异性。

选用多个STR位点:当母亲与胎儿基因型不同时，会导致额外条带的出现，此时即使缺乏父源DNA验证，也能够很容易地判别非母源条带，即胎儿DNA。但也存在这样的可能性，即父母在某一位点至少有一条带相同，从而可能导致孕妇血浆DNA图谱中不出现非母源条带，造成判读困难。因此需要选用多个高度多态性的STR位点作联合检测，以保证胎儿DNA的检出。

总之，以孕妇口腔拭子DNA作为母源性DNA对照，选用多个特异性的STR位点进行联合分析，可用于在某些无法得到父本DNA的情况下进行的产前诊断。

［1］易萍，李力，夏季，等.母体血浆中胎儿DNA分析在性连锁遗传病产前诊断中的应用［J］.第三军医大学学报，2007，29(6):538

［2］史惠蓉，王慧玲，孔祥东，等.应用巢式 PCR扩增孕妇血浆中胎儿 SRY基因［J］.郑州大学学报:医学版，2008，43(1):39

［3］雷冬梅，陈晓蕾，李晓文.孕妇血浆中游离胎儿DNA的SRY、DXS8377 检测［J］.中国妇幼保健，2008，23(25):3 585

［4］Bischoff FZ，Lewis DE，Simpson JL.Cell-free fetal DNA in maternal blood:kinetics，source and structure［J］.Human Reprod Update，2005，11(1):59

［5］李勤，张毅，丁宇烽，等.孕妇血样采集后体外存放对血浆中胎儿游离DNA水平的影响［J］.第二军医大学学报，2008，29(9):1 042

［6］González-González C， Garcia-HoyosM， Trujillo-Tiebas MJ，et al.Application of fetal DNA detection in maternal plasma:a prenatal diagnosis unit experience［J］.J Histochem Cytochem，2005，53(3):307