高效液相色谱法测定黑香豆中香豆素的含量

董宇静 张玉英

1.广东药学院药科学院；2.广东药学院基础学院，广东 广州 510006

1 实验方法

1.1 色谱条件的选择

本组实验采用LC-1OATvp液相色谱仪：日本岛津。N2010色谱工作站（中国科学院生产）。微型旋涡振荡器（WH-1）。离心机（80-2）。除甲醇为色谱纯外，其余均为分析纯试剂。C18色谱柱，5μm，250×4.6mmi.d；柱温：35℃；流动相：甲醇：5mmol/L Tris缓冲溶液（pH4.5，5：95，V/V）；紫外可见检测器，根据全波长扫描结果确定检测波长310nm。

表1 批内精密度试验（mg/ml）

1.2 对照品与样品溶液的制备

精密称取香豆素对照品0.010g，于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为母液，精密吸取母液2mL于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，后经0.45μL滤膜过滤，得滤液即为对照品溶液。然后准确称取晒干粉碎后的黑香豆粉末各1.0g，加80%乙醇50mL，常温下，超声波提取1h，冷却后过滤，共提取2次，合并滤液，滤液减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解并转移至50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。准确吸取2mL，于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，经0.45μL滤膜过滤，得滤液即为供试样品。

1.3 标准曲线的绘制

取香豆素母液，分别准确吸取1.0，4.0，8.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。准确吸取上述溶液各20μL，在相应的色谱条件下进行分析。得线性回归方程：Y=38.125X-7.164，r=0.9968。结果表明香豆素在50-50μg/mL呈良好线性关系。

2 结果

2.1 柱温的选择

固定其他条件，控制色谱柱温分别为20℃，25℃，30℃，35℃，40℃进行实验。实验结果表明，当色谱柱温为30℃时，香豆素的色谱峰发生拖尾或者重叠；柱温为25℃时，香豆素的分离度大于1.5、有较好的峰形和响应值，故本实验选择色谱柱温为25℃。

2.2 精密度实验

本组实验按选定的HPLC色谱条件，在同一天内连续8次测定标准溶液，以各组分的峰面积，计算日内精密度（以相对标准偏差RSD表示）。本法变异系数为1.02%-1.16%，符合测定要求的2%以内。具体情况见表1。

2.3 准确度实验

本组实验还同时进行了加标回收试验。分别加入高、低两种浓度水平的标准溶液，根据样品含量和加标后测定值计算加标回收率，由实验结果可知，香豆素的回收率为102.4%，有较好的回收率。

2.4 重现性试验

取黑香豆粉末6份，按2.1项方法制备样品溶液，后按上述色谱条件进行分析，结果表明重复性良好，香豆素平均质量分数为0.625%，RSD值为2.25%。

2.5 回收率试验

取1.0g黑香豆粉末按上述方法制备样品溶液各6份，准确加入20，30，40μg/mL的香豆素对照品各10g，进行3组平行试验，每组2份，按上述色谱条件进行分析。结果表明回收率良好，平均回收率为100.50%，RSD为1.50%。

3 讨论

高效液相色谱法（HPLC）是发展较快也较成熟的分析方法，具有高效、高速、高灵敏度及高度自动化等特点，尤其适用于高沸点，不能气化，热稳定性差的有机物及各种离子的分离分析[1-2]。它是一种非破坏性的技术手段，可以达到制备、定性、定量的目的[2-4]。本论文以黑香豆为原料，对其有效成分香豆素进行了提取测定研究，开发出一条基于高效液相色谱法的黑香豆中香豆素的提取测量路线，此工艺路线操作简便、速度快、安全、无污染，为进一步放大试验及其工业化生产提供了较为详尽的技术方案和试验数据。同时考察了高效液相色谱法定量分析方法，并进行其相关方法学的研究，结果令人满意。

[1] 卢艳花.中药有效成分提取分离技术[M].化学工业出版社，2006：218－19.

[2] 梁明金，杨广德，贺浪冲.白芷中欧前胡素的提取方法研究[J].2000，22（12）：529－531.

[3] 何际蝉.浅谈酶法在中药提取中的应用[J].中医药学刊，2005，23（9）：1713－1714.

[4] 刘红梅.均匀设计优选微波辅助萃取白芷香豆素类成分[J].华西药学杂志，2004，19（3）：193－195.