白细胞介素10对失血性休克大鼠肺的保护作用

刘 玉,谈大海,,唐季春,,尤 杰,杨定清,张 焰,曾因明

(1.江苏无锡市第四人民医院麻醉科 214062;2.江苏省麻醉学重点实验室,江苏徐州221002)

失血性休克能够诱发单核细胞和巨噬细胞的强烈激活,释放大量的炎性细胞因子IL-1、IL-6以及 TNF-α等,导致急性肺损伤的发生进而可发展成为急性呼吸窘迫综合征甚至多器官功能不全,最后导致患者死亡[1]。白细胞介素10(IL-10)抑制脓毒血症时促炎性因子IL-1、IL-6、IL-12以及 TNF-α的释放,内源性的IL-10在体内调节细胞因子平衡减轻炎性反应方面发挥重要的作用[2-5]。本实验采用失血性休克大鼠模型,应用外源性重组人IL-10干预,观察其对失血性休克大鼠血液中促炎性细胞因子表达以及肺炎症反应程度的影响,并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 选择健康雄性SD大鼠24只,体重300～400g,由徐州医学院实验动物中心提供。随机分为3个组(n=8):假失血性休克对照(Control)组、休克(Shock)组和IL-10+休克(IL-10)组。重组人白细胞介素10(rhIL-10),由上海欣百诺生物科技有限公司提供。

1.2 失血性休克模型制作 大鼠于实验前适应饲养环境7d,采用灯光照明的方法使昼夜时间均为24h,实验前12h禁食不禁饮。腹腔注射2%戊巴比妥钠50mg/kg麻醉后,仰卧固定于大鼠手术台,分离一侧股动、静脉并置入22G套管,股动脉套管留作放血及监测平均动脉压,股静脉套管留作注入复苏液体和放出的血液。通过动脉以0.5mL/min速度放血,使平均动脉压(MAP)达到50mm Hg,放出的血液储存于无菌加肝素的容器,通过放出或回输血液使MAP维持于 35～45mm Hg,持续120min[6]。

大鼠复苏时采用其放出的自身血液加上等量的生理盐水溶液,Shock实验组大鼠在休克起始时皮下注射10 000单位的重组人IL-10(rhIL-10用2mL 0.9%氯化钠溶解)[6-7],Shock组大鼠在休克起始时皮下注射2mL 0.9%氯化钠溶液,Control组大鼠仅作动静脉置管并维持测压状态同样时程,然后拔除动、静脉置管,结扎血管,缝合切口,放回原饲养场所待其自然清醒和自由饮食。实验期间以白炽灯照大鼠,保持直肠温度36.5～ 37.5℃。

1.3 标本制备及检测

1.3.1 复苏24h时,放血活杀动物之前,经由左心室采血3mL,1mL作血气分析,剩余2mL分离血清,按试剂盒说明测定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。MDA试剂盒、SOD活性检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.2 支气管肺泡灌洗液中性粒细胞比值、肺通透指数及细胞因子测定。大鼠处死后,取全肺,剪开气管,经气管插管缓慢注入4℃无菌生理盐水灌洗2次,每次灌洗量为5mL。将2次回收的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)经双层无菌纱布过滤后3 000r/min离心15min,取细胞沉淀涂片,显微镜下计数肺泡灌洗液中细胞总数及中性粒细胞并计算所占百分比;Lowry法测定BALF和血浆蛋白含量,计算肺通透性指数(BALF蛋白含量/血浆蛋白含量);上清液于-20℃冻存,ELISA法测定灌洗液上清液及血液中IL-1、IL-6及TNF-α含量。IL-1、IL-6及 TNF-α试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产。

1.3.3 肺湿/干重(W/D)比测定 取右下肺叶组织,滤纸沾干肺表面水分,精确称重后置烤箱60℃干燥至恒重后测定肺脏干质量,计算肺湿干重以估计肺组织的水肿程度。肺湿/干重比(mg/g)=(肺湿重-肺干重)/肺干重。

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件包进行分析。所有数据以表示,组内比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 一般情况及生存率 Control组大鼠不进行放血及复苏,Shock组放血量(7.51±0.82)mL,IL-10组大鼠放血量(7.86±0.63)mL,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。24h后Control组大鼠没有死亡,Shock组大鼠在复苏后2h内死亡1只,5h死亡1只,24h死亡1只。IL-10组在休克复苏后6h死亡1只,复苏后24h死亡2只,与Shock组相比差异无统计学意义。

2.2 血清各项血气指标 与Control组相比,Shock组PaO2和pH值均明显降低,二氧化碳分压(PaCO2)明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01);与Shock组相比 IL-10组PaO2和pH值升高,PaCO2降低,差异有统计学意义(P＜0.05);IL-10组与Control组相比,PaO2、PaCO2和pH 值差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.3 3个组大鼠肺通透指数(LPI)、肺湿/干重比值 与Control组相比,Shock组大鼠肺通透指数、肺湿/干重比显著增大,差异有统计学意义(P＜0.01);与Shock组相比,IL-10组大鼠肺通透指数、肺湿/干重比值明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01)(表 2)。

表1 3个组大鼠各项血气指标的比较(n=8)

表1 3个组大鼠各项血气指标的比较(n=8)

▲:与Control组比较,P＜0.01;★:与Shock组比较,P ＜0.01。

组别 PaO2(kPa)PaCO2kPa)PH Control组 13.70±0.67 4.28±0.55 7.41 ±0.05 Shock组 7.21±0.84▲ 6.29±0.62▲ 7.26±0.05▲IL-10组 12.84±0.73★ 4.47±0.51★ 7.38±0.04★

表2 3个组大鼠W/D比值、LPI和BA LF中性粒细胞比值(n=8)

表2 3个组大鼠W/D比值、LPI和BA LF中性粒细胞比值(n=8)

▲:与Control组比较,P＜0.01;★:与 Shock组比较,P＜0.01。

组别 W/D比值 LPI(10-3)BA LF中性粒细胞(%)Control组 4.65±0.15 5.12±0.36 15.6±4.3 Shock组 7.03±0.12▲ 13.61±0.54▲ 56.89±7.8▲IL-10组 5.17±0.22★ 5.81±0.42★ 27.1±5.6★

2.4 3个组大鼠支气管肺泡灌洗液中性粒细胞比值 结果见表2,与Control组相比,Shock组大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数明显增多,中性粒细胞计数比显著增大,差异有统计学意义(P＜0.01);IL-10组与Shock组相比,大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞计数比明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.5 3个组大鼠血清中SOD、M DA含量的比较 Shock组大鼠血清中MDA水平较Control组显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01),而IL-10组较Shock组则明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);RL组大鼠血清中SOD水平较Control组显著下降,而IL-10组较Shock组则显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01),见表 3。

2.6 各组大鼠支气管肺泡灌洗液上清液及血清中IL-1、IL-6、TNF-α水平 Shock组大鼠支气管肺泡灌洗液中 IL-1、IL-6、TNF-α水平较Control组显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01),而 IL-10组较RL组则明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01),见表 4。

表3 3个组大鼠血清中SOD和M DA含量的比较(n=8)

表3 3个组大鼠血清中SOD和M DA含量的比较(n=8)

▲:与Control组比较,P＜0.01;★:与 Shock组比较,P＜0.01。

组别 MDA含量(nmol/mL)SOD含量(u/mL)Control组 3.75±0.62 85.17±9.41 Shock组 7.32±0.54▲ 36.28±7.37▲IL-10组 4.19±0.73★ 67.91±13.82★

表4 3组大鼠支气管肺泡灌洗液上清液及血液中IL-1、IL-6、TNF-α水平pg/mL)

表4 3组大鼠支气管肺泡灌洗液上清液及血液中IL-1、IL-6、TNF-α水平pg/mL)

▲:与Control组比较,P＜0.01;★:与 Shock组比较,P＜0.01。

IL-1IL-6TNF-α组别BALF 血清BALF 血清BA LF 血清Control组 30.5±16.8 152.6±63.4 42.7±14.5 85.8±13.4 58.1±34.9 265.8±103.7 Shock组 178.3±42.1▲ 461.7±193.6▲ 171.9±88.3▲ 424.6±182.9▲ 670.8±227.4▲ 1 869.6±732.8▲IL-10组 91.4±57.6★ 217.5±165.8★ 61.9±32.6★ 128.3±93.4★ 162.9±78.1★ 610.5±279.3★

3 讨 论

失血性休克是创伤后患者死亡的主要原因之一。早期阶段患者死亡主要是由于出血没有得到控制,经历休克和复苏存活的患者往往会发生难以控制的系统性炎症反应最终导致终末器官损伤甚至死亡,而急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征则是主要的死亡原因[8]。

在急性肺损伤发生的过程中,促炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和 TNF-α的大量释放发挥关键的作用[1]。IL-10是一种免疫调节细胞因子,能够减轻多种创伤刺激后过度的炎症反应。IL-10通过抑制NF-κ B等途径抑制促炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12 等的合 成[3,9-12],促进 中性 粒细胞 凋亡[13],从而减轻肺部的炎症反应。同时IL-10缺陷的大鼠失血性休克后易于并发肺部损伤而肝脏损伤的概率并没有增加[14],而外源性的IL-10应用也显示能够减轻伤害刺激诱发的免疫功能障碍[15]。

在伤害刺激后IL-10的释放或者给予IL-10显示良好的效应[16],在休克的早期应用 IL-10能够减少 TNF-α的剧烈增加[6]。本研究结果证明在失血性休克起始阶段给予外源性的重组白细胞介素10与单纯复苏相比在各项血气指标方面得到了很大的改善,说明给与rhIL-10能够改善肺泡的氧合。本研究结果显示IL-10组大鼠肺湿/干重、肺通透指数与Shock组大鼠相比均有明显的降低,IL-10组血清中 MDA含量低于Shock组,而SOD含量高于Shock组,说明 HSPTX复苏失血性休克大鼠能够降低肺毛细血管通透性。同时,结果显示IL-10组大鼠BALF上清液及血液中 IL-1、IL-6、TNF-α水平较Shock组显著降低,表明给予IL-10可以有效地减少促炎性细胞因子的释放并减轻肺部的炎症反应,尽管实验结果与Karakozis等[6]并不完全一致。

值得注意的是,本实验选择的时间点是失血性休克复苏后24h,在24h内虽然IL-10组的肺部炎症反应得到了有效的控制,然而IL-10组与Shock组相比生存率差异无统计学意义。本研究没有观察远期时间点肺部炎症反应的变化和生存率的比较,因此,可能给予外源性的IL-10只是推迟炎症反应而没有阻止炎症反应。IL-10的过量释放本身会导致机体免疫机能的低下,增加感染的可能性,尤其是在脓毒血症的患者是非常有害的[16]。在无菌性炎症中,IL-10能够发挥良好的抗炎效应,但是也有可能抑制机体的免疫功能,增加机体后期致命性感染的发生,因此,临床上应用IL-10还需要进一步的验证。

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