乙酰半胱氨酸及氢化可的松对重症急性胰腺炎治疗作用的实验研究

蔡笃雄,陈卫昌,曾仕平,汤 净,林尤冠

(1.海南医学院附属医院消化内科,海口570102;2.苏州大学附属第一医院消化内科,苏州215006)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是临床上常见的危重疾病,病情进展迅速,早期容易并发全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),死亡率高。因此,早期干预治疗防止急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)由轻型向重症发展成为目前重要的研究课题。本实验通过建立大鼠SAP模型,并给予N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)预处理及氢化可的松治疗,以探讨NAC及氢化可的松对SAP的治疗保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD大鼠72只,清洁级,体重200～250g,由苏州大学医学院实验动物中心提供。牛磺胆酸钠(95%)购自Sigma公司,IL-6试剂盒购自Bender Medsystems公司,TNF-α试剂盒购自北京晶美生物工程公司,组织髓过氧化物酶(MPO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所,TNF-α及β-actin引物由上海生工生物工程公司合成,N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)购于上海源聚生物科技公司,氢化可的松琥珀酸钠注射剂购自天津市生物化学制药厂。

1.2 实验分组及动物模型的制备 72只SD大鼠随机分为4个组。(1)SAP组:18只,参照钱明平等[1]的制模方法以0.1 mL/3min的速度向胰胆管内逆行注入5%牛磺胆酸钠(1mL/kg)建立大鼠SAP模型。大鼠SAP的诊断以病理检查胰腺组织出现腺泡细胞的变性坏死、炎症细胞浸润及胰腺周围出血为标准并参照Schmidt的病理学评分标准。(2)NAC处理组:18只,于模型制作前30min腹腔内注射5%NAC(200mg/kg)进行预处理。(3)氢化可的松治疗组:18只,于SAP模型制作成功后10min给予舌下静脉注射氢化可的松琥珀酸钠(10mg/kg)。(4)假手术(SO)组:18只,开腹后仅翻动胰腺,即关腹。各组分别于术后3、6h和12h腹主动脉抽血(各组每时点6只),分离血浆保存于-20℃中备测,将大鼠处死,留取胰头部胰腺组织并分为两部分,一部分用10%甲醛固定,用于光镜组织病理学检查,另一部分快速置液氮中保存,用于提取组织匀浆检测组织MPO;留取肺组织,右上肺组织用10%甲醛固定,用于光镜组织病理学检查,剩余肺组织分3部分置液氮中保存,右下肺组织用于提取组织匀浆检测组织MPO,左上肺组织用于检测肺湿/干比值,左下肺组织用于检测肺组织中TNF-α mRNA的表达。

表1 各组大鼠各时点血浆 AM Y、TNF-α、IL-6水平、胰腺及肺组织MPO的水平、肺湿/干比值、肺组织TNF-α mRNA的表达水平及胰腺组织病理学评分

1.3 观察指标和检测方法

1.3.1 血浆淀粉酶采用全自动生化分析仪(Olympus AU-2700)检测,血浆 TNF-α、IL-6采用ELISA方法检测,严格按试剂盒说明进行操作。

1.3.2 胰腺及肺组织MPO 采用酶化学法测定,以每克组织湿片在37℃的反应体系中 H2O2被分解1μ mol为 1个酶活力单位,MPO(单位/克湿片)=〔测定管吸光度(A)值-对照管A值〕/(11.3×取样量),该指标反映组织中中性粒细胞的聚集程度。

1.3.3 肺组织湿干比值测定 将左下肺组织从液氮中取出后称湿重,然后将肺组织置于60℃烘箱内烘烤72h,去除水分,取出称干重,所得的数值为肺干重,肺湿/干比值为肺湿重/肺干重,该指标反映肺水肿的程度。

1.3.4 病理学检查及评分 胰腺及肺组织经10%甲醛固定、石腊包埋、HE染色后于光镜下观察,并根据Schmidt等的病理学评分标准对胰腺组织进行评分。

1.3.5 肺组织TNF-αmRNA的表达 采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测,PCR反应条件分别为β-actin:94℃×30s,60℃×30s,72℃×30s;TNF-α:94℃×30s,60℃×30s,72℃×30s共30个循环,结束前72℃×7min以充分延伸。TNF-α引物序列如下:TNF-α(312bp)正义 5′-CTC AAA GAC AAC CAA CTG GTG GTA C-3′,反义 5′-ACA GAG CAA TGA CTC CAA AGT AGA CC-3′,以β-actin(219bp)为内参照,用 TNF-α/β-actin的光密度比值作为肺组织 TNF-α mRNA表达量的测定指标。

2 结 果

2.1 血浆淀粉酶、TNF-α、IL-6水平 SAP组各时间点血浆淀粉酶水平均较SO组显著升高(P＜0.01),NAC处理组各时间点血浆淀粉酶均较SAP组明显降低(P＜0.05),差异均有统计学意义。氢化可的松治疗组各时间点血浆淀粉酶水平均较SAP组降低,但差异无统计学意义(P＞0.05),见表 1。SAP组各时间点血浆 TNF-α、IL-6水平均明显高于 SO组(TNF-α:3h时 P＜0.05,6、12h时P＜0.01;IL-6:3、6h时 P＜0.05,12h时P＜0.01),NAC处理组各时间点血浆TNF-α水平及3、6h时IL-6水平均较SAP组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05),但12h时IL-6水平与SAP组相比较差异无统计学意义(P＞0.05)。氢化可的松治疗组各时间点血浆 TNF-α、IL-6水平均较SAP组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 胰腺及肺组织M PO水平 SAP组各时间点胰腺及肺组织MPO水平均明显高于SO组(胰腺M PO:3h时 P＜0.05,6、12h时P＜0.01,肺组织 MPO:3h时 P＜0.05,6、12h时 P＜0.01),NAC处理组各时间点胰腺及肺组织M PO水平均较SAP组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。氢化可的松治疗组各时间点胰腺MPO水平与SAP组比较差异均无统计学意义(P＞0.05),各时间点肺组织M PO水平均较SAP组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 肺组织湿/干比值 SAP组 6、12h肺组织湿/干比值均明显高于SO组,差异有统计学意义(P＜0.01),NAC处理组及氢化可的松治疗组6、12h肺组织湿/干比值均明显低于SAP组,差异有统计学意义(P＜0.05),NAC处理组及氢化可的松治疗组各时间点与SO组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.4 肺组织中TNF-αmRNA的表达 SO组肺组织中 TNF-α mRNA呈微弱表达,SAP组各间点肺组织TNF-αmRNA表达水平均较SO组明显增加(P＜0.01),NAC处理组及氢化可的松治疗组各时间点肺组织中TNF-αmRNA的表达水平均较SAP组显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)(表 1、图1)。

2.5 胰腺及肺组织病理改变 SO组光镜下胰腺组织基本正常,SAP组可见胰腺腺泡水肿及腺泡结构消失,叶间隔、小叶间隔及腺泡间隔显著增宽,大量炎症细胞浸润,腺泡细胞呈不同程度变性坏死,胰腺周围出血,随着时间的延长,病变呈进行性加重。NAC处理组各时间点胰腺水肿、出血及炎症细胞浸润均较SAP组减轻,少数偶见局灶性腺泡细胞变性坏死,氢化可的松治疗组胰腺水肿、出血、坏死及炎性细胞浸润仍较明显,各时间点与SAP组比较未见明显减轻。病理学评分:SAP组各时间点胰腺组织病理学评分均显著高于SO组(P＜0.01),NAC处理组6、12h胰腺组织病理学评分均明显低于SAP组(P＜0.05),氢化可的松治疗组各时间点胰腺组织病理学评分与SAP组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)(表1)。SO组光镜下肺组织无明显变化,SAP组可见肺泡壁水肿,肺间质及肺泡腔有大量中性粒细胞及单核细胞浸润,肺泡结构紊乱,肺内可见散在出血灶,肺血管内可见血栓形成,且随着时间的延长,病变逐渐加重。NAC处理组及氢化可的松治疗组各时间点肺泡壁、肺间质水肿均较SAP组减轻,炎症细胞浸润明显减少,肺泡结构基本正常,肺内未见出血灶。

图1 4个组大鼠各时点肺组织TNF-α mRNA的表达电泳图

图2 各组6h时胰腺组织的病理改变(HE×100)

图3 各组12h时肺脏组织的病理改变(HE×100)

3 讨 论

重症急性胰腺炎(SAP)的发病机制尚未完全阐明,研究表明,重症急性胰腺炎由于众多炎症介质和细胞因子的瀑布样级联反应,从而导致 SIRS和并发急性肺损伤,其中 TNF-α、IL-6在SAP的发生、发展中具有重要的作用[2],早期对SAP发病过程中的 TNF-α、IL-6进行干预对SAP具有重要的治疗保护作用[3]。

TNF-α、IL-6等细胞因子的转录、合成受核因子-κ B(NF-κ B)的调控,在SAP时大量的氧自由基激活 NF-κ B,并进一步激活IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子的转录、合成,促进细胞因子的大量生成,从而导致SIRS和 MODS。Hyeyoung等[4]研究发现,运用抗氧化剂NAC能抑制大鼠AP时胰腺组织NF-κ B的激活,使胰腺细胞内上述细胞因子表达显著降低,从而改善AP的病情。另外,动物研究表明,给予氢化可的松预处理或治疗后能显著降低SAP时 TNF-α、IL-6水平,明显提高动物生存率[5]。本实验中,SAP组血浆 TNF-α、IL-6水平显著升高,给予 NAC预处理及氢化可的松治疗能显著降低血浆TNF-α、IL-6水平,结果表明,NAC及氢化可的松可通过减少TNF-α、IL-6的产生发挥抗炎症效应,改善SAP的病情。

研究发现,SAP时肺组织中TNF-αmRNA呈现强烈与持久的表达,TNF-αmRNA的表达水平与肺损害程度呈正相关[6]。本实验中,SAP组肺组织TNF-αmRNA的表达显著增加,NAC处理组及氢化可的松治疗组肺组织TNF-αmRNA表达水平均较SAP组显著降低,肺组织病理损伤较SAP组明显减轻,表明给予NAC预处理及氢化可的松治疗对SAP肺损伤可能具有重要的治疗保护作用。

本实验中,给予NAC预处理能显著降低SAP时胰腺及肺组织MPO水平,明显降低肺湿/干比值,并能明显减轻胰腺及肺组织的病理损伤,表明给予NAC预处理能明显减轻胰腺及肺组织中中性粒细胞的浸润,减轻胰腺及肺组织的炎症反应,改善SAP时胰腺及肺组织损伤。另外,给予氢化可的松治疗能显著降低SAP肺组织中M PO的水平及肺组织湿/干比值,并能明显减轻各时间点肺组织的病理损伤,提示给予氢化可的松治疗能明显减轻肺组织炎症反应及肺水肿,改善肺组织损伤。但在本实验中,氢化可的松治疗组血浆淀粉酶水平、胰腺组织MPO水平、胰腺组织病理学评分与SAP组比较均无明显差异,胰腺组织病理损伤与SAP组相比未见明显减轻,说明氢化可的松治疗并不能改善SAP时胰腺组织的病理损伤。

综上所述,NAC及氢化可的松可通过减少细胞因子TNF-α、IL-6的产生,改善 SAP的病情,早期应用抗氧化剂及激素进行干预对重症急性胰腺炎具有一定的治疗保护作用。

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