三叶肽TFF1在大肠癌中的表达

周 斌,吴 斌,徐 亮,黄小红

(1.扬州大学附属泰兴市人民医院胃肠外科,江苏扬州225400;2.泸州医学院附属医院普外科,四川泸州646000)

三叶肽TFF1(trefoilfactor family 1)是三叶因子家族成员之一,该家族包含3个成员:乳腺癌相关肽(pS2/TFF1)、解痉挛多肽(SP/TFF2)和小肠三叶肽(ITF/TFF3)。三叶肽具有保护胃肠黏膜、促进损伤组织愈合及肿瘤抑制等作用。Wu等[1]研究发现,给予烧伤后实验鼠hTFF1融合蛋白灌胃,能明显改善实验鼠胃黏膜损伤。有研究发现,在上皮重建的体外模型上,即在连续的细胞单层上人为造成刮伤,当加入三叶肽后,上皮细胞向损伤部位的移动速率比对照组增加3～6倍。Karam等[2]研究TFF1缺乏鼠证实,TFF1为胃癌抑制基因,TFF1敲击鼠的胃幽门窦黏膜凹陷细胞的祖细胞与胃癌生成有关。在正常情况下,TFF1在胃小凹上皮细胞(主要在胃底和胃窦黏液细胞)表达,在大肠黏膜组织中不表达,因此本研究TFF1在大肠正常组织及大肠腺瘤、腺瘤恶变、大肠癌组织中的表达,分析其与临床病理特征的关系,探讨TFF1在大肠癌发生中可能的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 搜集泸州医学院附属医院普外科2004年1～12月住院患者中大肠腺瘤27例,大肠腺瘤恶变22例,大肠癌40例,并取因外伤而行部分结肠切除患者正常大肠组织20例。其中男62例,女47例;年龄35～87岁,平均 57.75岁。将手术切除标本(约2.0 cm×1.5 cm×0.3 cm大小)制成石蜡标本,4℃冰箱保存。以上标本均经病理检查证实。

1.2 试剂 TFF1单克隆抗体(购于北京中山生物技术有限公司)和免疫组化染色试剂盒(SP-9002,购于北京中山生物技术有限公司)。

1.3 检测方法 采用链亲合素生物素免疫过氧化物酶法(streptavidin-biotin immunoperoxidase method,S-P)检测所取组织中TFF1的表达。操作步骤:(1)石蜡切片,常规脱蜡至水。(2)3%H2O2去离子水孵育5～10 min,以消除内源性过氧化物酶活性,蒸馏水冲洗,PBS浸泡5 min。(3)热抗原修复,电炉加热至沸腾后断电,自然冷却。(4)滴加封闭用正常山羊血清工作液,室温孵育10～15 min,倾去,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗,37℃孵育2～3 h或4℃过夜。(5)PBS冲洗3次,每次3 min。滴加生物素化二抗工作液,室温或37℃孵育10～15 min。PBS冲洗3次,每次3 min。(6)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温或37℃孵育10～15 min。(7)PBS冲洗3次,每欠 3 min。显色剂显色(DAB)。(8)自来水冲洗。苏木精复染,脱水,透明。树脂封片,显微镜下观察。

1.4 统计学处理 全部数据均用SPSS10.0统计软件处理。计数资料两组之间比较用非参数检验中Ridit分析,相关性分析以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TFF1表达 以大肠腺体细胞处出现棕黄色颗粒为TFF1表达阳性,根据细胞染色强度将切片分为阴性(-)、阳性(+)、中度阳性(++)、强阳性(+++)。其判断标准为:每张切片随机选取3个高倍视野(×400),(-):高倍视野中无阳性细胞;(+):高倍视野中阳性细胞数小于25%;(++):高倍视野中阳性细胞数为25%～50%;(+++):高倍视野中阳性细胞数大于50%。其中同一切片中(++)和(+++)表达细胞之和大于30%为明显表达。正常大肠组织及大肠腺瘤、腺瘤恶变、大肠癌组织中 TFF1表达情况见表1。

表1 TFF1表达情况

2.2 TFF1与大肠癌临床、病理指标的关系

2.2.1 TFF1表达与Dukes分期的关系 40例大肠癌患者中,Dukes A期7例,B期12例,C期13例,D期8例,见表2。

表2 TFF1因子表达情况与Dukes分期的关系

2.2.2 TFF1表达与肿瘤分化程度的关系 40例大肠癌患者中,高分化10例,中分化14例,低分化16例,见表3。

表3 TFF1因子表达情况与肿瘤分化程度的关系

2.2.3 TFF1表达与淋巴结转移的关系 40例大肠癌患者中,有淋巴结转移23例,无淋巴结转移17例,见表4。

表4 TFF1因子表达情况与淋巴结转移的关系

3 讨 论

三叶肽TFF1是三叶因子家族成员之一,是胃肠道激素的一种,在胃肠道黏膜损伤修复过程中发挥重要作用。在正常情况下,TFF1在胃小凹上皮细胞(主要在胃底和胃窦黏液细胞)表达,在大肠黏膜组织中不表达。本研究结果也表明,在正常大肠组织中,无1例TFF1表达,大肠腺瘤、大肠腺瘤恶变时,TFF1表达,与大肠正常组织比较差异有统计学意义(P＜0.05)。大肠癌时,TFF1表达明显,与正常大肠组织、大肠腺瘤、腺瘤恶变比较差异均有统计学意义(P＜0.05),且其总表达的百分率和明显表达的百分率居最高。提示TFF1的表达与大肠病变、肿瘤发生有关。Mochizuka等[3]研究表明,TFF1在大肠腺瘤、大肠增生性息肉中表达上调。

TFF1的这种表达特性,在大肠癌的发生、发展中其作用机制可能有以下3个方面:(1)三叶肽TFF与黏液糖蛋白MUC相互作用形成黏液胶样层,从而保护消化道黏膜避免有害因子的损伤。但三叶肽和黏液糖蛋白分布均有组织特异性,在正常大肠黏膜组织中,MUC2、MUC3阳性表达,二者与TFF3相互作用形成黏液胶样层,而 TFF1正常应在胃黏膜组织中表达,与MUC1、MUC5AC、MUC6形成黏液胶样层[4],因此异位分布的TFF1与大肠黏膜组织的M UC2、MUC3相互作用减弱,不能保护大肠黏膜避免有害因子的入侵。(2)既往研究表明TFF1在胃癌中表达缺失,被视为胃癌的抑癌基因[2],与大肠癌不同,提示TFF1在不同肿瘤发生机制中的复杂效应。Bossenmeyer-Pourié等[5]发现 TFF1在胃肠道细胞中有抗增殖和抗凋亡双重特性。三叶肽的黏膜修复涉及到 ras依赖性有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和上皮生长因子受体(EGFR)的激活,这些途径与E-钙黏附因子由细胞表面向细胞内重新分布和蛋白激酶B(PKB)的磷酸化有关,而这种酶与抗凋亡有关;三叶肽还能阻断与EGFR和p13激酶有关的p53依赖或非依赖途径的凋亡[6]。因此长期慢性炎症导致机体内环境紊乱,TFF1表达增强,不易凋亡的损伤组织细胞逐渐恶变,可能向大肠肿瘤发展。(3)有研究指出,TFF1在消化道、泌尿系统炎症性疾病和肿瘤中高表达,猜想TFF1和Cdc25A-B协同其他优势致瘤途径诱导腺瘤和腺瘤恶变,以TFF1、Cdc25信号通路为靶目标治疗TFF1阳性实体肿瘤患者是有益的[7]。Abdou等[8]研究证实,TFF1在前列腺癌中高表达,Amiry等[9]研究发现,TFF1在乳腺癌细胞中高表达,抗TFF1的表达可作为乳腺癌治疗的一种新的治疗策略。

本研究还发现,TFF1在Dukes B、A期和高、中分化大肠癌时表达明显,且TFF1表达与淋巴结转移不相关。TFF1在正常大肠黏膜组织中不表达,在大肠腺瘤、腺瘤恶变时开始表达,大肠癌时表达明显。但本研究发现,在肿瘤晚期、恶性程度最高、明显淋巴结转移时TFF1反而表达不明显。究其原因,可能与大肠癌晚期时大肠正常黏膜破坏严重、致黏膜分泌TFF1的细胞功能丧失有关。周林静等[10]研究后得出相似结论。Tuna等[11]指出,TFF1在直肠腺癌发展中参与了肿瘤入侵,与术后复发可能有关。

总之,三叶肽 TFF1在大肠正常黏膜组织中无表达,大肠腺瘤时开始表达,大肠癌时表达明显,提示TFF1在大肠癌的发生、发展中可能起着一定的作用,其可能机制有待进一步研究。

[1]Wu W,Wang L,Sun Y,et al.Influence of human trefoil factor 1(hTFF1)fusion protein on gastric mucosal lesion in mice after burn injury[J].Zhonghua Shao Shang Za Zhi,2008,24(6):421.

[2]Karam SM,Tomasetto C,Rio MC.Amplification and invasiveness of epithelial progenitors during gastric carcinogenesis in trefoil factor 1 knockout mice[J].Cell Prolif,2008,41(6):923.

[3]Mochizuka A,Uehara T,Nakamura T,et al.Hyperplastic polyps and sessile serrated′adenomas′ of the colon and rectum display gastric pyloric differentiation[J].Histochem Cell Biol,2007,128(5):445.

[4]Emami S,Le Floch N,Bruyneel E,et al.Induction of scattering and cellular invasion by trefoil peptides in src-and RhoA-transformed kidney and colonic epithelial cells[J].FASEB J,2001,15(2):351.

[5]Bossenmeyer-Pourié C,Kannan R,Ribieras S,et al.The trefoil factor 1 participates in gastrointestinal cell differentiation by delaying G1-S phase transition and reducing apoptosis[J].J Cell Biol,2002,157(5):761.

[6]Podolsky DK.Mechanisms ofregulatory peptide action in the gastro-intestinal tract:trefoil peptides[J].J Gastroenterol,2000,35 Suppl:S1269.

[7]Rodrigues S,Rodrigue CM,Attoub S,et al.Induction of the adenoma-carcinoma progression and Cdc25A-B phosphatases by the trefoil factor TFF1 in human colon epithelial cells[J].Oncogene,2006,25(50):6628.

[8]Abdou AG,Aiad HA,Sultan SM.pS2(TFF1)expression in prostate carcinoma:correlation with steroid receptor status[J].APMIS,2008,116(11):961.

[9]Amiry N,Kong X,Muniraj N,et al.Trefoil factor-1(TFF1)enhances oncogenicity of mammary carcinoma cells[J].Endocrinology,2009,150(10):4473.

[10]周林静,赵长宏,鲁海玲,等.TFF1和 HSP70在结肠癌中的表达及临床意义[J].实用肿瘤学杂志,2007,21(2):111.

[11]Tuna B,Sökmen S,Sarioglu S,et al.SPS2 and HSP70 expression in rectal adenocarcinomas:an immunohistochemical investigation of 45 cases[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2006,14(1):31.